韩慧芬

（如皋市精神病防治医院，江苏 如皋 226500）

大黄为临床常用泻下中药，为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.，或药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根和根茎。大黄性寒味苦，归脾、胃、大肠、肝、心包经[1]。现代药理学研究表明大黄具有良好的体内外抑菌活性[2-3]。大黄的化学成分研究表明其主要含有蒽醌类化合物，包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚等[4]。大黄所含有的蒽醌成分与大黄整体抑菌效果相关性如何未见报道[5]。中药谱效关系研究是通过数学模型建立内在化学成分与药效关联的一种新的研究方法[6]。通过中药谱效关系研究，可以认识到主要活性成分在中药整体中所起的作用及贡献度的大小。连翘中咖啡酸、连翘酯苷A、连翘苷和连翘脂素与连翘抗金黄色葡萄球菌活性之间存在密切的关联性[7]。对线叶菊进行抗菌活性谱效关系研究，发现了9个共有抑菌成分，为阐述线叶菊的物质基础提供了依据[8]。笔者对大黄的不同炮制品醇提取物中蒽醌建立指纹图谱，并对样品的抑菌效果进行评价，通过多元回归等数学模型建立大黄不同炮制品中蒽醌与抑菌效果之间的联系，为阐述大黄抑菌效果的物质基础提供依据。

1 材料

1.1 仪器Agilent 1260高效液相色谱仪（配有四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器及Chem Station色谱工作站）；CPA225D型电子天平（德国Sartorius公司）；MICRO-17R冷冻离心机（美国Thermo公司）；Milli-Q Advavtage A10超纯水机（美国Millipore公司）；WH-2微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）。

1.2 试药大黄饮片购自南通三越中药饮片有限公司（批号：180217、180725、181109），经如皋人民医院邵建兵副主任中药师鉴定，大黄饮片均为掌叶大黄Rheum palmatum L.的根及根茎。芦荟大黄素（批号：110795-201710）、大黄酸（批号：110757-201607）、大黄素（批号：110756-201913）、大黄酚（批号：110796-201922）、大黄素甲醚（批号：110758-201817）、金黄色葡萄球菌（批号：26003-9a）、大肠埃希氏菌（批号：44103-9a1）、绿脓假单胞菌（批号：10104-2a26）购自中国食品药品检定研究院。胰酪胨大豆琼脂培养基（TSA）购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。色谱纯甲醇、色谱纯乙腈、分析纯磷酸等试剂购自南京化学试剂股份有限公司。

2 方 法

2.1 色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温：40℃；检测波长：254 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL；流动相：A-乙腈，B-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱：0~8 min，20%~25%A；8~16 min，25%A；16~31 min，25%~45%A；3 1~41 min，45%~60%A；41~53 min，60%~71%A；53~54 min，71%~20%A。

2.2 溶液的制备

2.2.1对照品溶液制备 分别取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚适量，精密称定，加甲醇分别制成每1 mL含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各80 μg，大黄素甲醚40 μg的溶液；分别精密量取上述对照品溶液各2 mL，混匀，即得（每1 mL中含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各16 μg，含大黄素甲醚8 μg）。

2.2.2 大黄不同炮制品的制备大黄，去除杂质，洗净润透，切厚片，晾干得到生大黄饮片。熟大黄与大黄炭的制备方式参照中药炮制规范[9]。简言之，净大黄饮片加入50%黄酒拌匀，闷润2 h，待黄酒被药材吸尽后，密封蒸制24 h内部呈黄褐色，晾得熟大黄；净大黄片用（200±20）℃武火炒至表焦黑内焦褐色，取出，得大黄炭炮制品。每个批次重复3次，各得到生大黄、熟大黄和大黄炭样品共27份。

2.2.3 样品液制备取干燥的各大黄炮制品，粉碎饮片成粉，过80目筛。分别称取大黄各炮制品粉末100 g，用8倍纯化水回流提取2次，每次30 min，滤过，浓缩定容到200 mL，得到大黄不同炮制品的样品液。取制备好的样品液1 mL，定容至25 mL，0.45 μm滤膜过滤，供液相色谱分析。

2.3 方法学的考察

2.3.1 精密度试验 精密吸取供试品溶液10 μL，连续进样6次，测定芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积，计算RSD。

2.3.2 稳定性试验 精密吸取供试品溶液10 μL，于制备后的0、3、6、9、12和24 h分别进样，测定芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积，计算RSD。

2.3.3 重复性试验 称取大黄炮制品粉末各约100 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，分别精密吸取10 μL进样，测定芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积，计算RSD。

2.4 大黄不同炮制品抑菌实验参照《中华人民共和国药典》通则操作，将制备好的培养基以无菌操作加入90 mm无菌培养皿中，制成培养基平板，每个平板分别加入浓度为1×105CFU/mL的金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、绿脓假单胞菌的悬液0.1 mL，无菌玻璃棒均匀涂布[10]。以打孔器在涂菌的平板上打3孔（每孔直径6 mm）。每孔加入无菌水配置的浓度为0.5 g/mL大黄不同炮制品溶液100 μL，以无菌水制作空白对照。37℃培养24 h，记录抑菌圈直径。

3 结果与讨论

3.1 大黄不同炮制品色谱图分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。大黄不同炮制品色谱特征图见图1。在此分析方法下，各蒽醌成分分离度良好。

图1 高效液相色谱图

3.2 方法学结果精密度结果表明，此分析方法下芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的RSD分别为1.16%、0.41%、1.57%、0.89%和1.24%，表明仪器精密度良好。稳定性结果表明，不同时间点芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的RSD分别为1.21%、1.18%、1.09%、0.84%和1.07%，表明大黄炮制品样品在24 h具有良好的稳定性。重复性结果显示，重复制备的生大黄炮制品样品中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量分别为0.271、38.846、2.021、3.347、1.487 mg/g，RSD分 别 为3.21%、2.18%、3.09%、3.84%和3.07%，表明方法具有良好的重复性。

3.3 大黄炮制品中蒽醌含量测定分别取制备好的不同大黄炮制品溶液10 μL，注入液相色谱仪进行分析，结果见表1。

表1 不同大黄炮制品中蒽醌含量测定结果（mg/g，n=3）

3.4 大黄不同炮制品抑菌实验采用十字交叉法测定大黄不同炮制品抑菌圈直径（d），按下公式计算抑菌圈面积，结果见表2。

表2 大黄不同炮制品抑菌圈面积（mm2，n=3）

续表2：

3.5 大黄蒽醌抑菌多元回归分析将实验得到的大黄中蒽醌含量数据与大黄抑菌数据导入SPSS进行多元线性回归分析处理，以芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量作为自变量X1-5，以各种细菌抑菌圈面积作为因变量Y，以多元线型回归-逐步回归法建立大黄蒽醌抑菌方程。所得方程见表3。

表3 大黄抑菌作用的谱效方程

3.6 主成分分析（PCA）将大黄蒽醌含量及抑菌面积数据导入SPSS进行主成分分析，寻找出对大黄抑菌有较大相关性的指标。由SPSS导出主成分因子相关矩阵，如表4所示。结果表明大黄酸和芦荟大黄素是大黄抑菌主要活性成分群。分析总方差判断主要影响因子，结果见表5。结果表明大黄酸和芦荟大黄素在抑菌方面起主要作用。（见图2）

表4 大黄成分的PCA分析因子载荷矩阵

表5 大黄蒽醌抑菌总方差解析表

图2 大黄化学成分抗菌效能PCA分析图

4 讨 论

4.1 中药物质基础研究是探索中药起效机制的重要组成部分中药谱效关系建立的难点在于选择合适的评价体系，和适宜的统计学方法。大黄具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒等广泛的临床应用，不可能建立某一种模型来评价大黄的整体功效。因此，本文选择大黄体外抑菌模型对大黄蒽醌类成分进行分析。之前已经有多个研究表明大黄具有良好的体外抑菌效果，不同炮制品之间抑菌能力具有明显差别，但未建立起大黄化学成分与抑菌能力之间的相关性。笔者通过液相色谱含量测定不同炮制品中蒽醌含量，并与抑菌能力进行多因素回归分析，建立大黄蒽醌成分与抑菌能力之间的谱效方程，并通过主成分分析，芦荟大黄素、大黄酸在大黄抑菌中起到主要的作用。

4.2 大黄在炮制后蒽醌类成分发生了明显的变化熟大黄中芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量较生品中有不同程度的上升，大黄酸含量与生大黄中相当。大黄炭中芦荟大黄素、大黄酸含量降低明显，而大黄酚和大黄素甲醚含量上升[11]。抑菌实验中对于金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞杆菌作用结果表明，大黄经过炮制变成熟大黄其抑菌能力没有明显变化，而经过炮制成炭后，抑菌能力明显下降，与文献报道一致[12]。经过回归和主成分分析，表明芦荟大黄素和大黄酸起到主要的抑菌作用。

中药由于多成分、多靶点的作用特点，决定了其物质基础作用机制研究将会是一个复杂的网络体系。本文以其中的一个点，对传统中药抑菌的物质基础进行初步探索，为了解中药复杂体系提供了科学依据。