陈 恺，邓巧娟，贾 真，郝林端

（广东医科大学附属医院，广东 湛江 524001）

慢性阻塞性肺疾病（以下简称“慢阻肺”）为呼吸科常见慢性气道炎症疾病，以持续性进展的气流受限为主要特征，对我国居民具有巨大消极影响[1]。研究发现[2]，慢阻肺中存在十分复杂的炎症因子网络参与并扩大炎症进程。目前临床上主要通过药物治疗来达到松弛气道平滑肌、帮助患者打开肺部气道并有效减轻气道炎症、减少黏液产生的目的[3]。根皮素是一种存在于苹果、梨等多种水果与蔬菜汁液中的天然活性物质，有极强的抗氧化活性和抗炎作用[4-5]。目前临床上关于根皮素在炎症相关疾病甚至肿瘤治疗过程中发挥积极作用的研究较多，但关于其在慢阻肺方面的研究较为贫乏。因此，本研究将讨论根皮素发挥慢阻肺气道保护作用的机制，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 主要试剂和仪器根皮素粉（根皮素含量≥98%，批号：1887240）自Sigma公司购入；IL-1β（货号：69-30375）、TNF-α（货号：69-30484）ELISA检验试剂盒自默沙克生物公司购入；HE染色试剂盒（货号：E607318）自生工生物工程（上海）股份有限公司购入；黏蛋白5AC抗体（ab3649）、GAPDH(ab9485)抗体自艾博抗（上海）贸易有限公司；ERK抗体（APR12683G）、p-ERK抗体（APR12831G）自Bioworld公司购入；山羊抗兔二抗（31430）、山羊抗小鼠二抗（31460）自赛默飞世尔科技（中国）有限公司购入；PCR所需试剂自日本TaTaRa公司购入；香烟为大前门牌香烟。

ABI 7500型实时荧光定量PCR仪、Multiskan FC酶标仪自美国ThermoFisher Scientific公司购入；RC system小动物呼吸机自美国Buxco公司购入；RM2235型轮转式组织切片机自德国徕卡公司购入；BX43光学显微镜购自日本olympus公司。

1.2 慢阻肺大鼠造模及分组

1.2.1 实验动物 取清洁级SD成年雄性大鼠36只，体质量195～272（231.14±19.65）g，均购自常州卡文斯生物科技发展有限公司，动物生产许可证号：SCXK（苏）2011-0003。本研究已经本院伦理委员会审批（编号：2018-116）。

1.2.2 造模、分组 将36只SD大鼠随机分为对照组、慢阻肺组、根皮素干预组，每组12只。大鼠分笼饲养，每日自由进水，食颗粒饲料，保持大鼠笼具温度在22～24℃，相对湿度维持在50.0%～70.0%，照明、造影、换气等条件均控制在规定范围内，并每日定时清洁笼具卫生，定时添加或者更换大鼠饮用水和饲料，隔天更换笼具。持续喂养2 d后开始建模。对照组大鼠持续上述自由喂养4周；慢阻肺组和根皮素干预组大鼠采用香烟烟熏（CS）+脂多糖（LPS）气管内滴注复合因素的方式造模。在造模第1天、第14天，将大鼠以10.0%水合氯醛按照0.3 mg/100 g进行腹腔麻醉，然后将大鼠固定在鼠板上，完全暴露其喉头，并用静脉套管针替代导管，对大鼠进行气管插管，通过静脉套向大鼠气管内滴注LPS 0.2mL，完毕后将大鼠直立旋转15 s左右，确保LPS能够均匀地分布在大鼠肺部。第2～13天，第15～28天，实验人员每天在有机玻璃密闭箱内持续输入新鲜的香烟烟雾60 min，20支/d，1 h/d，造模28 d结束。以大鼠肺功能和肺组织病理学改变来作为判定造模成功依据。

1.2.3 给药 根皮素干预组：将根皮素溶于1% DMSO溶液中，在造模开始的第15天开始灌胃，剂量为100 mg/kg，3 mL/次，1次/d，连续给药2周。对照组和慢阻肺组大鼠均给予等体积的生理盐水灌胃处理，在造模开始的第15天开始灌胃，1次/d，连续给药2周。

1.3 各组大鼠肺功能指标的检测造模结束后，用10%水合氯醛3 mL/kg注射大鼠腹腔进行麻醉，而后仰卧固定于操作台上，在颈部皮肤位置纵向切开约2 cm切口，机械钝性分离皮下组织，使气管完全暴露，而后气管插管两端分别和流速、压力传感器相连，流速传感器对应端分别与流速、压力传感器连接，流速传感器对应端和小动物呼吸机（美国Buxco公司）连接。设置潮气量10 mL/kg，呼吸频率60次/min。将流速、压力传感器分别连接Maclab数据记录分析系统（美国Buxco公司），描记一段平静呼吸后，在呼气末用注射器经三通管迅速以相当于潮气量5倍的气量进行充气，而后立即脱开，连接-25 cm H2O负压抽气造成深呼气，所引起的容积变化经微机处理计算出第0.3秒用力呼气容积（FEV0.3）/FVC、气道阻力以及动态肺顺应性。

1.4 各组大鼠炎性因子水平检测各组大鼠眼球采血，3 000 r/min离心15 min，取上清，-20℃保存，采用ELISA法测定各组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平。

1.5 HE染色大鼠处死后，沿大鼠肺门剪下大鼠右肺，PBS洗涤，将副叶、后叶置于4%中性甲醛中进行固定，常规脱水处理，石蜡包埋后进行HE染色。其中前叶、中叶放置于液氮中冻存，用于后续的Western blotting实验。

肺组织蜡块处理成5 μm厚的连续切片，放在60℃烤箱中烤片2 h以防止脱片。HE染色步骤：将切片依次用二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化；取苏木精染色5～10 s，取出漂洗，用1%盐酸乙醇分化5～10 s，漂洗，进行伊红染色1～2 min；继续进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明处理；用中性树脂进行封片。在光镜下进行组织病理学观察。

1.6 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测各组大鼠黏蛋白5AC mRNA、IL-1β mRNA表达取大鼠肺组织适量，用Trizol提取组织的总RNA，并按照反转录试剂盒说明书，进行反转录合成cDNA。在10 μL反应体系中，加入2×SYBR荧光染料混合液5 μL，10 μmol的上下引物各1 μL，模板DNA 1 μL，双蒸馏水2 μL。反应条件：95℃、5 min，95℃、10 s，60℃、30 s，40个循环。黏蛋白5AC上游引物：5’-AATGGCTACCTGAACCTCCTCC-3’，下游引物为：5’-AAACTCGCTGGATTCTGGACTG-3’；IL-1β上游引物为：5’-TTAGGAAGACACGGATTCCAT-3’，下游引物为：5’-ATGGCAACTGTTCCTGAACTC-3’；以GAPDH为内参，其上游引物为：5’-CAACGGGAAACCCATCACCA-3’，下游引物：5’-ACGCCAGTAGACTCCACGACAT-3’。实验结果采用2-△△Ct法由计算机自动计算并读出定量结果，进行相对定量分析。

1.7 蛋白质免疫印迹法检测各组大鼠肺组织黏蛋白5AC、ERK和p-ERK蛋白表达取适量肺组织，加入1 mL RIPA细胞裂解液，3 000 r/min离心10 min，留上清液，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。在上清液样品中加入等量的2×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，沸水浴10 min，待样品冷却到室温后，把蛋白样品直接上样至SDS-PAGE胶加样孔内进行电泳分离，以200 mA恒定电流在冰上转16 h，转移目的蛋白至PVDF膜，并在Western洗涤液中漂洗5 min，加入封闭液，在摇床上缓慢摇动，而后在室温下封闭2 h。接着往其中分别加入黏蛋白5AC、ERK、p-ERK和GAPDH一抗，在4℃温度下缓慢摇动孵育24 h，用TBST洗涤液洗涤3次。加入用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗稀释液，在室温下封闭2 h，而后继续用TBST洗涤3次；之后用ECL发光试剂盒来检测蛋白水平，借助Image J软件分析蛋白条带灰度值，内参为GAPDH。

1.8 统计学方法采用SPSS 21.0对所有数据进行统计学分析处理，计量资料结果用（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较方差齐采用LSD-t检验，方差不齐采用Tamhane T2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠造模后一般情况观察对照组大鼠呼吸平稳且无痰鸣音，大鼠毛发有光泽，食量、体质量均匀增加，状态活泼好动。慢阻肺组大鼠呼吸频率加快，且大鼠出现咳嗽、打喷嚏、痰鸣音、气喘、鼻腔分泌物增多、毛发蓬松、甚至精神萎靡等情况，大鼠食量减小，大便质稀，甚至部分大鼠出现体质量降低情况；随着造模时间延长，上述症状加重。根皮素干预组大鼠的一般情况处于上述两种状态之间。

2.2 各组大鼠肺组织病理情况HE染色结果显示，对照组大鼠的呼吸道、肺泡上皮及支气管壁结构完整，纤毛排列齐整，大鼠的气管及各级支气管仅见散在的杯状细胞，并未出现腺体增生、管壁水肿或者明显炎细胞浸润的状况。慢阻肺组大鼠的支气管壁存在大量炎性细胞附着，并且有一些肺泡管、细支气管扩张成不规则腔状结构，一些肺泡融合成肺大泡，气管黏膜上皮坏死、脱落甚至杂乱状，能看到明显的杯状细胞和腺体增生的情况。根皮素干预组大鼠的支气管仅观察到少量炎性细胞附着，且肺泡间隔破坏情况明显较慢阻肺组大鼠轻，但依旧观察到杯状细胞增生及肺泡腔扩张的情况。（见图1）

图1 HE染色观察各组大鼠肺组织病理情况（×100）

2.3 各组大鼠肺功能比较慢阻肺组大鼠FEV0.3/FVC、动态肺顺应性明显低于对照组（P＜0.05），气道阻力显著高于对照组（P＜0.05）；根皮素干预组大鼠FEV0.3/FVC、动态肺顺应性均明显高于慢阻肺组（P＜0.05），气道阻力低于慢阻肺组（P＜0.05）。（见表1）

表1 各组大鼠肺功能比较（±s）

表1 各组大鼠肺功能比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05，与慢阻肺组比较，bP＜0.05

组别 动物数（只）FEV0.3/FVC（%）动态肺顺应性（mL/cmH2O）气道阻力[cmH2O/（mL·s）]对照组 12 83.55±3.16 0.40±0.04 0.41±0.03慢阻肺组 12 59.51±3.61a 0.17±0.02a 0.62±0.06a根皮素干预组12 73.23±4.82b 0.32±0.02a b 0.47±0.03a b F 74.233 230.389 91.888 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 各组大鼠血清炎症因子水平比较慢阻肺组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平明显高于对照组（P＜0.05）；根皮素干预组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平均明显低于慢阻肺组（P＜0.05）。（见表2）

表2 各组大鼠血清炎症因子水平比较（±s，pg/mg）

表2 各组大鼠血清炎症因子水平比较（±s，pg/mg）

注：与对照组比较，aP＜0.05，与慢阻肺组比较，bP＜0.05

组别 动物数（只） IL-1β TNF-α对照组 12 63.63±19.06 88.88±10.52慢阻肺组 12 132.18±23.22a 260.32±27.68a根皮素干预组 12 86.37±16.88a b 181.19±11.41a b F 36.963 263.137 P＜0.001 ＜0.001

2.5 各组大鼠黏蛋白5AC蛋白及黏蛋白5AC mRNA、IL-1β mRNA表达水平Western blotting检测结果显示，慢阻肺组大鼠肺组织黏蛋白5AC的蛋白表达水平明显高于对照组（P＜0.05），根皮素干预组大鼠肺组织黏蛋白5AC的蛋白表达水平明显低于慢阻肺组（P＜0.05）。经RT-qPCR检测，慢阻肺大鼠黏蛋白5AC mRNA和IL-1β mRNA的相对表达量均显著高于对照组（P＜0.05），根皮素干预组大鼠黏蛋白5AC mRNA和IL-1β mRNA的相对表达量明显低于对照组（P＜0.05）。（见图2、表3）

图2 各组大鼠肺组织MUC5AC蛋白表达情况

表3 各组大鼠黏蛋白5AC蛋白及黏蛋白5AC mRNA、IL-1β mRNA表达水平比较（±s）

表3 各组大鼠黏蛋白5AC蛋白及黏蛋白5AC mRNA、IL-1β mRNA表达水平比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05，与慢阻肺组比较，bP＜0.05

组别 动物数（只）黏蛋白5AC蛋白 黏蛋白5AC mRNA IL-1β mRNA对照组 12 0.05±0.01 1.00±0.03 1.03±0.03慢阻肺组 12 2.99±0.35a 2.38±1.17a 2.21±0.40a根皮素干预组 12 0.96±0.06ab 1.43±0.33ab 1.37±0.40ab F 656.999 12.064 832.127 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.6 各组大鼠肺组织ERK蛋白水平比较3组大鼠ERK1/2本底蛋白表达无明显差异（P＞0.05）；而在磷酸化活性形态方面，与对照组比较，慢阻肺组大鼠气道上皮P-ERK1/2表达明显上升（P＜0.05）；与慢阻肺组大鼠比较，根皮素干预组大鼠气道上皮P-ERK1/2表达明显下降（P＜0.05）。（见图3、表4）

图3 各组大鼠肺组织ERK蛋白表达情况

表4 各组大鼠肺组织ERK蛋白水平比较（±s）

表4 各组大鼠肺组织ERK蛋白水平比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05，与慢阻肺组比较，bP＜0.05

组别 动物数（只）ERK1/2 P-ERK1/2对照组 12 1.03±0.06 0.31±0.04慢阻肺组 12 1.02±0.05 1.55±0.16a根皮素干预组 12 1.00±0.07 0.51±0.04a b F 0.981 574.559 P 0.386 ＜0.001

3 讨 论

气道黏液高分泌症状作为慢阻肺的典型特征，是慢阻肺病情发展及预后的独立危险因素，与多种炎症因子、细胞因子及细胞信号通路存在密切关系[6]。黏蛋白5AC蛋白为分泌性黏蛋白，主要在支气管上皮杯状细胞中表达[7]。在健康生理状况下，黏蛋白5AC蛋白含量并不增加；但在慢阻肺者体内，人类内源性抗菌肽LL-37、TNF-α、IL-1β、IL-8、表皮生长因子（EGF）及中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）等含量明显增加，而这些因素会通过各种信号通路活化转录因子，并与相应的调节位点结合，对支气管上皮杯状细胞增生发挥促进作用，因而直接导致黏蛋白5AC蛋白及其mRNA在慢阻肺者体内表现为高表达状态[8-10]。

慢阻肺对人体损害极大，最终会造成劳动力丧失甚至死亡。因而，如何防治慢阻肺的发生、延缓其发展在目前临床上关注度较高。中药单体在慢阻肺治疗方面得到越来越多的关注，且目前临床上对中药在慢阻肺中的治疗作用的研究越来越多。余欢等[11]研究发现鱼腥草提取物能有效减缓慢阻肺大鼠肺组织损伤，可能是通过抑制ACE2、p38MARK通路发挥肺组织保护作用。刘灵等[12]通过对比试验发现，体外培育牛黄能显著减轻慢阻肺大鼠炎症反应，并对大鼠肥胖上皮细胞凋亡有一定积极意义。李玉屏等[13]研究表明，白藜芦醇能有效减轻慢阻肺大鼠肺组织内质网应激及内质网应激诱导的肺泡上皮细胞凋亡。既往研究表明[14]，根皮素能减轻γ-干扰素诱导的肺部纤维细胞炎症及CS诱导的气道炎症。意味着根皮素可能在慢阻肺疾病中同样具有一定的保护作用。闵捷[15]研究发现，根皮素能够显著抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖与迁移，并促进细胞凋亡。但目前临床上关于根皮素在慢阻肺方面的研究比较少见。

本研究建立了慢阻肺大鼠模型，从各组大鼠一般情况及组织病理形态可以看出，慢阻肺造模大鼠出现咳嗽、打喷嚏、痰鸣音、气喘、鼻腔分泌物增多等临床症状，且HE染色结果发现慢阻肺模型大鼠的支气管壁存在大量炎性细胞附着，还存在明显的杯状细胞和腺体增生的情况，与慢阻肺的主要病理特征相似，证明本研究模型制备成功。此外，从HE染色组织病理结果可以看出，根皮素干预组大鼠肺组织形态等各方面均较慢阻肺组大鼠明显改善。提示根皮素可能在慢阻肺的治疗过程中具有积极的意义。本研究采用根皮素干预慢阻肺大鼠后发现，根皮素干预组大鼠FEV0.3/FVC、动态肺顺应性以及气道阻力均明显较慢阻肺组大鼠改善；根皮素干预组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平明显低于慢阻肺组。说明根皮素能够有效改善慢阻肺炎症反应，改善肺功能，并能有效降低慢阻肺肺组织的病理损害。

本研究通过Western blotting、RT-qPCR法检测了黏蛋白5AC蛋白及黏蛋白5AC mRNA、IL-1β mRNA表达情况，结果发现根皮素干预组大鼠黏蛋白5AC蛋白及黏蛋白5AC mRNA、IL-1β mRNA的表达水平明显低于慢阻肺组；提示根皮素能够进一步降低黏蛋白5AC蛋白及炎症因子的表达，对慢阻肺气道黏液高分泌及炎症情况具有积极的治疗意义。此外，众多研究表明[16-18]，MAPK通路的磷酸化（包括P38激酶，ERK和JNK）被发现能促进炎症细胞因子和趋化因子的释放，在基因表达调控及多种疾病的发生过程中发挥着重要作用。ERK信号通路被认为在生长因子介导的细胞增殖、分化过程中发挥着重要作用[15]。而抑制ERK磷酸化，能够有效降低气道黏液高分泌。LI C L等[19]研究表明，在慢性阻塞性肺疾病的发展过程中，ERK激活产生促炎性细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6），加重气道炎症并破坏正常肺泡结构；采用调理肺汤处理可以下调p-ERK蛋白的表达，抑制ERK信号可以有效地抑制促炎细胞因子的产生。LIM H S等[20]研究发现，补骨脂酚可通过下调p38 MAPK/ERK信号通路抑制LPS诱导小鼠海马和皮质组织中小胶质细胞的炎症反应。本研究结果显示，根皮素干预组大鼠ERK1/2本底蛋白表达与其他各组无明显差异，P-ERK1/2蛋白明显低于慢阻肺组，说明根皮素能够抑制P-ERK1/2表达。提示根皮素可能通过抑制磷酸化活性形式的P-ERK1/2的表达来达到降低气道黏液分泌的目的，进而减轻肺组织炎症反应，有效修复肺组织，改善病情。

综上所述，经CS+LPS因素造模后，大鼠出现典型慢阻肺症状，且大鼠肺功能降低，炎症因子、黏蛋白5AC蛋白、ERK蛋白等分泌增加；经根皮素干预后，慢阻肺大鼠肺功能明显改善，炎性因子、黏蛋白5AC蛋白分泌减少，其作用机制可能与抑制ERK磷酸化有关。但由于中药普遍存在多靶点治疗的情况，可能还存在其他作用机制有待进行深入探讨。