奚倩慧，杨华元，白姗姗，周子依，舒 娅

（上海中医药大学针灸推拿学院，上海 201203）

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是青春期和育龄期女性常见生殖内分泌疾病，临床表现为月经稀发或持续性无排卵，多毛、痤疮等高雄激素症状，以及卵巢多囊样形态学改变。PCOS发病率达5%～10%[1]，是女性不孕的重要原因。胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）伴随PCOS的发病率可达44%～77%[2]，IR可加速雄激素合成，是PCOS发病与发展的关键因素，由此形成代谢与生殖功能的交互紊乱。

近年来，“中枢代谢-生殖整合”理论形成并提出，认为循环中的瘦素（Leptin，LEP）、脂联素、胃饥饿素等代谢因子可将代谢信号传递至下丘脑弓状核区域的Kisspeptin（KP）神经元，作为生殖中枢的KP神经元整合各类代谢信息，通过调控其所分泌的KP神经肽影响下丘脑GnRH神经元，开启和维持机体的生殖功能[3-4]。该理论揭示了代谢状态与生殖功能的关联性。由于电针在治疗PCOS过程中能同时影响生殖内分泌与代谢功能，可能与其调节下丘脑LEP表达，并沟通KP神经元，即下丘脑LEP/KP信号传导有关。该信号可下达至下丘脑-垂体-卵巢（HPO）轴，体现电针干预对代谢信号与生殖中枢的联动效果，从而实现同时改善生殖内分泌与代谢功能的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物3～4周龄SPF级雌性健康SD大鼠50只购于上海中医药大学动物实验中心，体质量：50～60 g，许可证号：SCXK（沪）2017-0005，适应性饲养5 d。实验过程中对动物的处理均遵照中华人民共和国科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》，并经上海中医药大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 药物与试剂硫酸普拉睾酮钠（上海源叶，1 g/瓶，批号：Y20S10Y98237）；盐酸二甲双胍片（中美施贵宝，0.5 g/片，批号：AAC5032，国药准字号：H20023370）；ELISA试剂盒：FINS（中国台湾Abnova，批号：KA3811），T（批号：XYE1289105）、FSH（批号：XYE1287931）、LH（批号：XYE1290417）、LEP（批号：XYE1277645）（上海信裕）；苏木素试剂（批号：714094）、伊红试剂（批号：BA4099）（珠海贝索）；SYBR Green PCR试剂盒（美国Thermo Fisher，批号：KAA0223S）；逆转录试剂盒（立陶宛Fermentas，批号：WKHF16225）；BCA蛋白定量试剂盒（美国Thermo Fisher，批号：PICPI23223）；Leptin抗体（北京博奥森，批号：BS0409R）；Kisspeptin抗体（英国Abcam，批号：AB19028）；GAPDH抗体（美国Proteintech，批号：6000411G）；羊抗兔HRP标记二抗（上海碧云天，批号：A0208）。

1.3 主要仪器一次性无菌针灸针（0.3 mm×25 mm，华佗牌）；G9805型低频电子脉冲治疗仪（上海医用电子仪器厂）；SQ2125型石蜡切片机（中国徕克）；ECLIPSE Ni显微镜（日本NIKON）；MK3酶标仪（芬兰Labsystems）；7300Real-time检测仪（美国ABI）；mini protean 3 cell电泳仪（美国BIO-RAD）；PS-9电转仪（大连竞迈）。

1.4 造模与分组

1.4.1 造模方法 随机选取42只大鼠作为造模组，根据谢阳等[5]的建模方法，采用硫酸普拉睾酮钠合并高脂饲料喂养诱导建立模型，造模组每日按体质量9 mg/100 g称取硫酸普拉睾酮钠，溶解于0.2 mL纯水，颈背部皮下注射。同时给予40%高脂饲料[上海斯莱康，含繁殖鼠料（54.6g/100g）、猪油（16.9 g/100 g）、蔗糖（14 g/100 g）、酪蛋白（10.2 g/100 g）、预混料（2.1 g/100 g）、麦芽糊精（2.2 g/100 g）]喂养。另随机取8只大鼠作为空白组，每日0.2 mL纯水颈背部皮下注射，常规饲料喂养。连续21 d。

1.4.2 模型鉴定与分组 造模第12天起，每日取阴道分泌物，10%亚甲兰染色，显微镜下观察表层细胞与底层细胞分布比例，判定动情期。以连续10 d（即2个动情周期）阴道脱落细胞失去规律性变化、无明显动情周期，提示无排卵，判定为PCOS造模成功。PCOS造模成功大鼠于第21天晚禁食，次晨目内眦取血，快速血糖仪测空腹血糖（FPG），酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测空腹胰岛素（FINS）。计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）=FPG（mmol/L）×FINS（mU/L）/22.5。以HOMA-IR＞2.8为造模成功的PCOS合并IR大鼠。判定结果为：24只大鼠PCOS合并IR造模成功。将造模成功的大鼠随机分为模型组、西药组和电针组，每组8只；空白组8只大鼠有规律排卵周期，可用于后续实验。

1.5 实验给药与干预电针组大鼠于特制固定装置制动，参照《实验针灸学》“常用实验动物针灸穴位”，选用“关元”、“中脘”、双侧“三阴交”及双侧“足（后）三里”，直刺穴位2～5 mm，针柄连接电刺激仪，关元、中脘一组，三阴交、后三里双侧各一组；采用疏密波，频率为4/20 Hz，治疗20 min，并每日予2 mL纯水灌胃1次，继续高脂饲料喂养，连续干预28 d。西药组大鼠按体质量250 mg/kg剂量将盐酸二甲双胍片溶于2 mL纯水，每日灌胃1次，并采用电针组固定法制动20 min，继续高脂饲料喂养，连续给药28 d。模型组大鼠继予高脂饲料喂养，每日采用电针组固定法制动20 min，2 mL纯水灌胃1次，连续干预28 d。空白组大鼠予常规饲料喂养，每日采用电针组固定法制动20 min，2 mL纯水灌胃1次，连续干预28 d。

1.6 观察指标

1.6.1 取材 治疗第28天晚禁食，次日大鼠予2%戊巴比妥钠麻醉，沿剑突方向开腹，取腹主动脉血，快速血糖仪测FPG，后将血液样本液氮速冻，24 h后转入-80℃冰箱保存待检。分离卵巢，洗净、吸干，称重后于10%福尔马林溶液固定，24 h后转入-80℃冰箱。固定头部，用咬骨钳打开颅骨，剥离脑膜，快速分离并取出全脑。根据《大鼠脑立体定位图谱》（人民卫生出版社，第三版），于大脑腹面下丘脑结节区，定位弓状核区域（前囟后2.0 mm～4.5 mm，中缝旁0.5 mm，紧靠正中隆起处），切取含弓状核的下丘脑组织，液氮速冻后转入-80℃冰箱保存待检。

1.6.2 血清睾酮（T）、促黄体生成素（LH）、促卵泡生成素（FSH）、空腹胰岛素（FINS）和瘦素（LEP）水平 采用ELISA法。根据试剂盒说明书，在孔板中加入相应标准品和待测样品，将辣根过氧化物酶标记的检测抗体添加到标准品孔和待测样品孔中，封板摇匀，37℃孵育60 min。弃液，洗涤，拍干。每孔加酶标试剂，封板，37℃温育60 min。弃液，洗涤，拍干。先后加入A、B显色剂混匀，37℃避光孵育10 min。以空白孔调零，加入终止液后用酶标仪在450 nm波长测量各孔OD值，计算样本浓度。

1.6.3 卵巢病理学观察 采用苏木素-伊红染色（Hematoxylin-Eosin，HE）法。10%福尔马林溶液固定后，乙醇逐级脱水，二甲苯液洗涤。恒温箱中蜡化，冷凝后取出切片。65℃烤片，二甲苯液脱蜡，乙醇逐级浸泡，放入苏木素溶液染色，氨水分色。清水冲洗后置入70%、90%乙醇脱水，放入伊红乙醇溶液染色，无水乙醇脱水。置于二甲苯液中透明，中性树胶封片，65℃烘干。光学显微镜下10×40倍观察并拍照。

1.6.4 下丘脑LEP mRNA、Kiss-1（Kisspeptin编码基因）mRNA和促性腺素释放激素（GnRH）mRNA表达水平 采用实时PCR法。总RNA提取：下丘脑组织于Trizol中匀浆提取，加氯仿-异丙醇-75%乙醇-无水乙醇洗涤，加DEPC水溶解RNA。按试剂盒说明，消除总RNA中的DNA（反应程序：37℃，30 min；加1 μL EDTA；65℃，10 min）及反转录（反应程序：37℃，60 min；85℃，5min；4℃，5min）。将cDNA进行PCR扩增，引物序列LEP，F：5'-CTGTGGCTTTGGTCCTATC-3'，R：5'-CAAGCTGGTGAGGATCTGT-3'；Kiss-1，F：5'-TGCTGCTTCTCCTCTGTG-3'，R：5'-AGGCTTGCTCTCTGCATA-3'；GnRH，F：5'-GGAGTCTACTGGCGTCTTC-3'，R：5'-TCCTCCTTGCCCATCTCT-3'；GAPDH，F：5'-GGAGTCTACTGGCGTCTTC-3'，R：5'-ATGAGC CCTTCCACGAT-3'。数据采用ABI Prism 7300 SDS Software分析。

1.6.5 下丘脑LEP、KP蛋白表达水平 采用蛋白质印迹（Western blotting）法。随机选取3个样本，按每20 mg组织碎片150～250 μL比例加入RIPA裂解液，匀浆至裂解，离心后取上清。BCA法测定蛋白浓度。将配制好的PAGE胶放入电泳槽中，将样品加入对应孔内。电泳，半干式转膜。2%丽春红染色蛋白检测。5%脱脂奶封闭，抗体加入封闭液中稀释，4℃孵育过夜。TBST洗涤，羊抗兔HRP标记二抗，37℃孵育1 h。TBST洗涤后加ECL发光液。放入成像系统扫描，Image lab分析。

1.7 统计学方法采用SPSS 24.0软件统计，计量资料用“均数±标准差”（±s）表示。多组间数据采用单因素方差分析，方差齐时采用Bonferroni检验比较、方差不齐时采用Dunnett`s T3检验比较；不符合正态分布，采用非参数检验法比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠性激素指标比较与空白组比较，模型组大鼠血清T、LH水平明显升高、FSH水平明显降低（P＜0.01）。与模型组比较，西药组大鼠血清T、LH水平明显降低（P＜0.01或P＜0.05），电针组大鼠血清LH水平明显降低（P＜0.01）。电针组大鼠血清T、LH和FSH水平与西药组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表1）

表1 各组血清性激素及LEP水平比较（±s）

表1 各组血清性激素及LEP水平比较（±s）

注：与空白组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01

血清性激素水平 血清LEP T(ng/mL) LH(ng/L) FSH(IU/L) 水平(μg/L)空白组 8 0.60±0.21 4.41±1.43 3.25±1.00 0.90±0.43模型组 8 1.06±0.30a 12.54±3.27a 1.66±0.58a 3.06±0.88a西药组 8 0.64±0.13b 6.12±3.16c 2.14±0.63 1.61±0.59c电针组 8 0.75±0.24 5.97±2.74c 2.16±0.45 1.52±0.34c组别 动物数（只）

2.2 各组大鼠卵巢HE染色观察空白组大鼠卵巢结构清晰、形态正常，可见黄体和不同发育阶段卵泡；模型组大鼠卵巢内多见囊性扩张卵泡，卵泡腔内卵母细胞或放射冠缺失，各阶段发育期卵泡及黄体少见，颗粒细胞层数减少；西药组大鼠卵巢内少量囊性扩张卵泡及封锁卵泡，部分卵泡腔内可见卵母细胞及放射冠；电针组大鼠卵巢内少量囊性扩张卵泡及封锁卵泡，可见各发育期卵泡及黄体。（见图1）

图1 各组大鼠卵巢组织病理图（HE，×400）

2.3 各组大鼠糖代谢指标比较治疗前，空白组、模型组、西药组和电针组大鼠血清FPG水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；模型组、西药组和电针组大鼠血清FINS水平及HOMAIR明显高于空白组（P＜0.01），且3组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后，与空白组比较，模型组大鼠血清FPG、FINS水平及HOMA-IR明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，西药组大鼠血清FINS水平、HOMA-IR降低（P＜0.05）；电针组大鼠HOMA-IR低于模型组（P＜0.05）；电针组大鼠血清FPG、FINS水平和HOMA-IR与西药组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表2）

表2 各组大鼠治疗前后血清FPG、FINS水平与HOMA-IR比较（±s）

注：与空白组比较，aP＜0.01，bP＜0.01；与模型组比较，cP＜0.05

血清FPG(mmol/l) 血清FINS(μIU/mL) HOMA-IR治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后空白组 8 4.28±0.63 4.50±0.54 17.30±1.50 18.77±1.08 3.32±0.73 3.74±0.33模型组 8 5.03±0.52 8.28±0.71b 26.18±5.91a 30.15±6.01b 5.84±1.27a 11.13±2.64b西药组 8 5.03±0.41 8.30±0.92 26.74±3.85a 22.31±2.67c 6.01±1.16a 8.26±1.64c电针组 8 4.54±0.38 8.01±0.83 26.30±3.45a 23.03±1.71 5.29±0.77a 8.20±1.01c组别 动物数（只）

2.4 各组大鼠血清LEP水平比较与空白组比较，模型组大鼠血清LEP明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，西药组与电针组大鼠血清LEP水平均明显降低（P＜0.01）；电针组大鼠血清LEP水平与西药组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表1）

2.5 各组大鼠下丘脑各物质mRNA表达比较与空白组比较，模型组LEP mRNA表达明显降低（P＜0.01），Kiss-1 mRNA、GnRH mRNA表达明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，西药组和电针组LEP mRNA表达均明显升高（P＜0.01），Kiss-1 mRNA表达与模型组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；西药组GnRH mRNA表达与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；电针组GnRH mRNA表达降低（P＜0.05），电针组LEP mRNA、Kiss-1 mRNA和GnRH mRNA表达与西药组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表3）

表3 各组大鼠LEP mRNA、Kiss-1 mRNA和GnRH mRNA相对表达比较（±s，GAPDH·10-3）

表3 各组大鼠LEP mRNA、Kiss-1 mRNA和GnRH mRNA相对表达比较（±s，GAPDH·10-3）

注：与空白组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01

组别 动物数（只）LEP mRNA Kiss-1 mRNA GnRH mRNA空白组 8 23.88±10.17 12.42±0.70 6.37±1.80模型组 8 7.45±4.47a 27.55±11.65a 21.71±10.54a西药组 8 15.08±3.34c 24.61±5.87c 13.75±5.40b电针组 8 14.90±4.10c 21.44±8.05c 10.59±5.25c

2.6 各组大鼠下丘脑各物质蛋白表达比较与空白组比较，模型组LEP蛋白表达明显降低（P＜0.01），KP蛋白表达明显升高（P＜0.01）；西药组LEP、KP蛋白表达与模型组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，电针组LEP蛋白表达升高（P＜0.05），KP蛋白表达与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；电针组LEP和KP蛋白表达与西药组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见图2、表4）

图2 各组大鼠LEP和KP蛋白相对表达灰度比较

表4 各组大鼠LEP和KP蛋白相对表达灰度值比较（±s，GAPDH·10-2）

表4 各组大鼠LEP和KP蛋白相对表达灰度值比较（±s，GAPDH·10-2）

注：与空白组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01

组别 动物数（只） LEP Kp空白组 3 65.08±9.49 19.10±3.36模型组 3 35.84±10.41a 54.09±2.53a西药组 3 48.38±4.16 47.81±4.30电针组 3 58.51±2.49b 40.99±9.26

3 讨 论

PCOS中医发病机理为脏腑功能失调，尤其是肝脾肾功能失调[6]引起的痰瘀互结阻滞冲任，引起胞宫失序。肝肾同源、互生精血，脾胃化精而生津统血，故肝脾肾功能失调可致精津血不能正化，反生痰饮、瘀血等病理产物，从而阻滞冲任。冲任是联系脏腑与胞宫的经络、运行气血的通道，乃女性生殖关键。吴效科团队提出中西医结合PCOS病机理论，认为“冲任”的生理作用包含了代谢与能量信息的整合与传递、生殖微环境的精准协调，以及以生殖为核心的整个机体功能的动员[7-8]。本实验选用关元、三阴交补肾培元、疏肝通络，足三里、中脘健脾化湿、消食导滞；且关元、中脘在任脉，三阴交联络足三阴经与冲任相通，足三里所在足阳明经与冲脉交会，诸穴共用不仅可以调补肝肾、健脾通络以祛瘀化痰，还能疏导脏腑气血灌注冲任，冲任充盛则胞宫滋盈。

临床试验表明，电针可降低PCOS患者IR程度，改善脂代谢，并恢复性激素水平[9]，对PCOS合并IR模型动物也有相似效果[10]。研究显示，电针在治疗PCOS过程中调节了少量中枢阿片肽，反馈性影响生殖中枢GnRH及下游LH和FSH的分泌[11]。实验结果显示，电针后模型大鼠下丘脑GnRH mRNA表达降低、LH下降，提示电针对生殖内分泌的作用可能从下丘脑开始，自性腺轴产生连续良性反馈。此外，电针兼具改善糖脂代谢疗效。二甲双胍可促进糖原利用，通过增加胰岛素受体，提高胰岛素敏感性，临床广泛应用于合并IR的PCOS患者。在本实验中，通过对所有大鼠共同进行束缚制动及灌胃操作，避免了不同操作手法对治疗结果造成的误差。结果显示，二甲双胍治疗PCOS合并IR的作用与电针治疗相比，对改善生殖内分泌与代谢功能的作用无显著差异。

LEP由脂肪细胞分泌，存在于外周血循环并表达于下丘脑，可以调节能量和生殖，与IR[12]及PCOS[13]发病有关。“中枢代谢-生殖整合”理论提出，LEP可将外周代谢信息传递至下丘脑生殖中枢，通过结合KP神经元上的LEP受体，直接调控KP神经元表达；或结合NPY/AgRP、POMC/CART等神经元上的LEP受体，并通过这些神经元与KP神经元之间的信号互通，间接改变KP神经元活性[14]。Kisspeptin（KP）神经元主要分布在下丘脑弓状核，由Kiss-1基因编码，是生殖中枢的战略组成部分，其分泌的神经肽KP可与GnRH神经元上的特异性受体结合，调节GnRH分泌，继而影响HPO轴活动，开启和维持生殖内分泌[15]。

实验结果显示，电针治疗可以增加PCOS合并IR大鼠下丘脑（含弓状核）LEP基因转录和蛋白表达水平，降低KP的基因转录水平。研究显示，电针可以提升下丘脑LEP水平治疗单纯性肥胖[16]，且调节脑缺血再灌注损伤相关血脑屏障通透性[17]。结合本实验推测，电针可能改善病理因素引起的LEP血脑屏障通透水平降低，促进LEP由外周向中枢的输送，从而改变下丘脑LEP表达。研究显示，电针可以激活去卵巢大鼠下丘脑KP系统，并调节GnRH及外周雌激素水平[18-19]。结合本实验推测，电针可能通过影响下丘脑LEP/KP信号途径，增加下丘脑LEP表达、降低KP表达，改善GnRH分泌，从而调节HPO轴活动及相关代谢紊乱，可能是治疗PCOS的潜在机制。由于二甲双胍可以在脑部各区域表达[20]，结合本实验推测，二甲双胍可能跨越血脑屏障，影响下丘脑LEP和KP表达，其效果与电针相当。

综上，电针调节了代谢信号LEP，并传递至下丘脑影响KP表达，体现了生殖信号接受代谢信号的调节，及两者在中枢的传导作用，符合“冲任”生理内涵所包含的对中枢、外周及微环境中与生殖相关信号的传递与整合作用。这一系列信号活动，是激发自身修复功能，开展整体协作的积极响应。电针可以影响下丘脑LEP/KP信号传导，可能是其同时调节PCOS生殖内分泌与代谢功能的作用机制，为进一步推广电针治疗该疾病提供新的实验依据。