刘丹彤 姚海荣 李 倩 齐冰丽 张纪炎

河北省沧州市中心医院(061000)

卵巢癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，已有研究表明，miRNA在卵巢癌的发展和转移过程中扮演了非常重要角色[1]。miR-363-3p是近年来发现的一个miRNA，在卵巢癌中发挥抑癌作用[2]。SOX4基因是SOX(SRY-related HMG-box)的家族成员，可促进卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭[3-4]。生物信息学筛查发现，SOX4可能是miR-363-3p的靶基因。miR-363-3p与SOX4在卵巢癌发展和转移过程中是否具有调控作用有待探究。本研究以卵巢癌SKOV3细胞为研究对象，初步探讨miR-363-3p靶向调控SOX4对卵巢癌SKOV3细胞的生物学行为。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

正常卵巢IOSE80细胞及卵巢癌SKOV3细胞购于上海江林生物科技有限公司。胎牛血清、RPMI1640培养基购于美国Gibco公司。Transwell小室购自美国Corning公司，Matrigel胶购自美国B&D公司。Lipofectamine TM2000 购自美国Thermo Fisher公司。蛋白双染marker、显影液、5%脱脂奶粉、Trizol试剂、一步法反转录荧光定量试剂盒及miR-363-3p、U6、SOX4、vimentin、E-cadherin和GAPDH引物购自上海生工生物科技有限公司。荧光素酶检测报告系统试剂盒购于美国Promega公司。miR-363-3p mimics及阴性对照(mimics NC)购自上海吉玛科技有限公司。兔抗SOX4单克隆抗体、兔抗vimentin单克隆抗体、兔抗E-cadherin单克隆抗体、兔抗GAPDH单克隆抗体及山羊抗兔IgG二抗购于艾博抗(上海)贸易有限公司。

1.2 miR-363-3p和SOX4 mRNA的表达

收集生长状态良好的对数生长期正常卵巢IOSE80细胞及卵巢癌SKOV3细胞，分别加入TRIzol提取RNA，参照一步法反转录荧光定量试剂盒检测miR-363-3p和SOX4的表达。miR-363-3p正向：5'-GGATTGCACGGTATCCA-3'，反向：5'-TTTGGCACTAGCACATT-3'；U6正向：5'-GCTTCG GCAGCA CA-3'，反向：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。SOX4正向5'- CAGCAAACCAACAATGCCGA-3'，反向：5'-GATCTGCGACCACACCATG-3'；GAPDH正向：5'-GACAGTCAGCCGCATCTTCT-3'，GAPDH反向：5'- GCGCCCAATACGACCAAATC-3'。

1.3 细胞转染及分组

将生长状态良好的对数生长期SKOV3细胞按照每孔2×105个接种至6孔细胞板上，置37℃、5% CO2和饱和湿度的培养箱中常规培养过夜。制备终浓度为80 nmol/L miR-363-3p mimics。根据转染试剂Lipofectamine TM2000说明书步骤转染，同时设置阴性对照mimcs NC组和空白对照组。通过RT-qPCR实验检测miR-363-3p转染效率。

1.4 Transwell实验检测各组迁移和侵袭的能力

收集各组转染48 h后的SKOV3细胞，每孔2×104个接种于Matrigel胶包被(未包被)的Transwell小室中，下室中加入含血清的培养液600μl，培养48 h后，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫溶液染色，棉签擦掉小室上层细胞，显微镜观察并拍照。

1.5 RT-qPCR实验检测各组SOX4、vimentin和E-cadherin mRNA的表达

收集各组转染48 h后的SKOV3细胞，按照1.2步骤进行操作。Vimentin正向5'-GAGCAGCAGAATAAGATCCTG-3'，反向5'-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGG-3'；E-cadherin正向5'-CATTTCTTGGTCTACGCCTG-3'，反向5'-GAGAGGAGTTGGGAAATGTG-3'。

1.6 Western Blot实验检测各组SOX4、vimentin和E-cadherin蛋白的表达

收集各组转染48 h后的SKOV3细胞，分别加入RIPA裂解液并在冰上放置20min，4℃ 13000 rpm离心20 min，采用BCA试剂盒测定上清蛋白含量。行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转PVDF膜，用2%BSA封闭液封闭，分别加入一抗4℃过夜，以GAPDH抗体为参照，再加入二抗室温孵育1 h。ECL曝光成像，采用Alpha Imager HP凝胶成像系统分析结果。

1.7 荧光素酶报告基因检测miR-363-3p和SOX4结合

构建野生型(SOX4-W)和突变型(SOX4-M)的SOX4 3’-UTR双荧光报告质粒。将对数生长期的SKOV3细胞以每孔105个接种至12孔细胞板上，将SOX4-W、SOX4-M与miR-363-3p mimics或mimics NC阴性对照共转染至SKOV3细胞。每组实验设置6个重复。培养箱培养48 h后，参照双荧光素酶报告基因检测试剂盒步骤检测荧光素酶活性。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 miR-363-3p和SOX4在细胞中的表达

RT-qPCR检测结果表明，卵巢癌SKOV3细胞中miR-363-3p的相对表达量(1.57±0.01)低于正常卵巢IOSE80细胞(11.13±0.30)(t=30.85，P<0.001)，SOX4的相对表达量(7.43±0.02)高于正常卵巢IOSE80细胞(0.86±0.03)(t=148.20，P<0.001)。

2.2 miR-363-3p mimics转染效率

miR-363-3p mimics组SKOV3细胞中miR-363-3p水平为3.43±0.06，mimics NC组SKOV3细胞中miR-363-3p水平为1.57±0.03，SKOV3 mimics的转染效率为84.14±1.22%。

2.3 过表达miR-363-3p对卵巢癌SKOV3细胞迁移和侵袭能力的影响

Transwell结果显示，与mimics NC组和空白对照组相比，转染miR-363-3p mimics的SKOV3细胞侵袭及迁移能力降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组SKOV3细胞迁移和侵袭数量比较(个，

2.4 过表达miR-363-3p对卵巢癌SKOV3细胞中SOX4、vimentin和E-cadherin表达的影响

RT-qPCR和Western Blot实验结果显示，miR-363-3p mimics组SOX4和vimentin表达均低于mimics NC组和空白对照组(P<0.05)，而E-cadherin表达高于mimics NC组和空白对照组(P<0.05)。见表2和图1(1539页)。

表2 各组SKOV3细胞中SOX4、vimentin、E-cadherin mRNA和蛋白表达比较

2.5 SOX4是miR-363-3p的靶基

应用starbase生物信息学网站预测SOX4 3’-UTR上存在miR-363-3p的结合位点(图2，1539页)。荧光素酶实验结果显示，在SOX4-W中，与mimics NC组相比，miR-363-3p mimics组荧光素酶活力值降低(t=19.60，P<0.001)。但在SOX4-M中荧光素酶的活性无明显变化(表3)。miR-363-3p靶向结合SOX4的3’-UTR。

表3 各组荧光素酶的活性

3 讨论

miRNA是新发现通过调控转录后基因表达来影响机体功能的一类小分子RNA，与肿瘤的发生发展有关。miR-363-3p是最近发现的一种肿瘤抑制因子[2,5-8]。通过靶向PCNA、PIK3CA、NOTCH1、NOB1、PDZD2等关键因子来调节肿瘤发生发展。miR-363-3p在肿瘤中的调控机制较复杂。本研究发现miR-363-3p在卵巢癌SKOV3细胞中表达量降低，在卵巢癌SKOV3细胞中转染miR-363-3p mimics后，可抑制SKOV3细胞的迁移和侵袭。提示miR-363-3p通过调控肿瘤细胞迁移和侵袭在卵巢癌发挥抑癌作用，但调控机制有待进一步探究。

SOX4是一种与发育密切相关的转录因子，参与细胞分化、祖细胞发育，以及PI3K、Wnt和TGF-β等多种信号传导。目前研究表明SOX4可在多种恶性肿瘤中异常表达，既可以发挥原癌基因的功能，也可以发挥抑癌基因的功能[9-10]。Li[3]和Xi[4]等结果表明在卵巢癌细胞上调SOX4可促进细胞增殖、迁移和侵袭。因此SOX4在卵巢癌是一种潜在的促癌基因。在本研究中，SOX4在卵巢癌SKOV3细胞中表达量升高，在miR-363-3p mimics转染后下调。另外，本研究应用双荧光素酶实验验证了miR-363-3p对SOX4有靶向调控作用。以上结果表明，SOX4是miR-363-3p的靶基因，miR-363-3p可能通过下调SOX4实现其功能。

上皮间质转化(EMT)与肿瘤转移密切相关。波形蛋白(vimentin)高表达和钙黏蛋白(E-cadherin)表达的缺失被认为是肿瘤细胞EMT的典型分子标记物[11]。目前发现Snail、Twist、ZEB1、ZEB2等多种转录因子，抑制E-cadherin、促进vimentin的表达而诱导EMT发生，提高细胞侵袭转移能力[12-14]。本研究结果表明，miR-363-3p mimics转染后，下调SOX4的同时也下调vimentin和上调了E-cadherin的活性。我们推测miR-363-3p可以直接抑制SOX4的表达，从而抑制EMT发生。该推测已在Zhang[15]等研究中得到证实，该研究表明SOX4是一个新的EMT诱导因子，通过激活TGF-β通路启动EMT程序促进乳腺癌进程。

综上所述，miR-363-3p在卵巢癌细胞迁移和侵袭过程中发挥重要抑癌作用，上调表达可有效抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭，其作用机制可能与靶向抑制SOX4表达有关。