刘亚萍，李雅睿，和水祥

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是消化系统常见恶性肿瘤之一，目前手术仍是其根治的主要手段，但因HCC转移能力强，往往发现时已进入晚期阶段，失去手术机会[1-2]。因此，针对转移途径研究，寻找HCC有效的治疗靶点成为目前研究的热点。

无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)通过选择性降解含有无义突变的mRNA，以避免异常蛋白产生和积累，是真核生物细胞中普遍存在的mRNA监管员[3-4]，此过程中上游移码蛋白(up-frameshift,UPF)发挥主要作用，其中UPF1是NMD过程的关键因子[5-6]。对部分肿瘤研究发现，UPD1参与肿瘤细胞增殖及转移过程[7]，而UPF1与HCC的关系目前尚不完全清楚。本研究从组织及细胞水平分别检测肝癌中UPF1表达情况，并分析UPF1表达与肝癌临床病理特征的关系，同时通过体外转染UPF1过表达质粒，检测其对肝癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响，并初步探讨其可能的机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2017年1～6月就诊于西安交通大学第一附属医院并行手术治疗的HCC患者共40例，其中男31例，女9例，年龄32～75岁，平均年龄56岁，每例均收集癌组织与对应的癌旁组织，患者术前均签署知情同意书，并经过医院伦理委员会批准。患者术前均未接受放化疗和免疫治疗，随访资料完整且所有组织标本均经术后病理检查证实。手术标本在切除获得后迅速置于液氮罐或-80 ℃冰箱中保存。

1.2 细胞株及主要试剂

人永生化肝细胞LO2、人肝癌细胞株HepG2、Hep3B、SMCC7721、MHCC-97H、MHCC-97L(购于上海生命科学研究院，由西安交通大学第一附属医院实验中心保存)，DMEM培养基(GIBCO公司，美国)，胎牛血清FBS(杭州四季青生物工程材料有限公司，中国)，胰蛋白酶、MTT、DMSO (Sigma公司，美国)，Transwell小室(Millipore公司，美国)； Matrigel基质胶(BD公司，美国)；蛋白提取RIPA改良试剂盒(西安沃尔森技术有限公司)；Western blot用β-Actin、UPF1、E-cadherin、N-cadherin及Vimentin一抗(Abcam公司，英国)、二抗体(西安壮志生物公司，中国)；RNA提取试剂Trizol、LipofectamineTM2000转染试剂盒(上海吉玛公司，中国)，反转录试剂盒(TaKaRa公司，日本)；β-Actin、UPF1、E-cadheri、N-cadherin及Vimentin基因引物设计及合成(北京奥科鼎盛生物技术有限公司，中国，见表1)；Premix Taq(大连宝生物工程有限公司)。

表1 目的基因的引物序列

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR检测相关基因表达 用Trizol试剂提取组织及细胞总RNA，其浓度及纯度采用紫外分光光度计检测。将RNA反转录为cDNA，之后进行PCR扩增，反应条件：95 ℃ 30 s, 95 ℃ 10 s, 58 ℃ 5 s，40个循环。基因表达量采用2-ΔΔCt法进行分析。

1.3.2 细胞培养及质粒转染 采用含10% FBS DMEM培养基培养细胞， 培养箱温度为37 ℃、CO2饱和湿度5 mL/L，培养2～3 d， 0.25%胰酶消化并传代，取对数生长期细胞用于实验。转染方法：转染前将细胞分别接种于96孔或24孔板，培养24 h至细胞融合度达80%，参照LipofectamineTM2000转染试剂盒操作说明进行转染。

1.3.3 MTT法和平板克隆形成实验检测细胞增殖 MTT法：取96孔板转染成功的细胞，每组平行设6个复孔，分别于24、48、72、96 h进行MTT检测，每孔加MTT 20 μL后孵育4 h后，弃培养液，每孔加DMSO 150 μL，置摇床上低速振荡10 min，酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光度(A)值。

平板克隆形成实验：取转染成功的肝癌细胞，以500个/孔的密度接种于6孔板，培养12 d，取出培养板，甲醇固定，吉姆萨液染色，计数克隆，以对照组形成的克隆数目为对照计算实验组的克隆形成率。

1.3.4 Transwell实验检测细胞侵袭及迁移能力 无血清DEME培养液(4 ℃)以8∶1比例稀释Matrigel基质胶，Transwell小室置入24孔板中，于上室中加入60 μL稀释胶，室温干燥过夜。用无血清DEME培养液调整细胞密度至1×108/mL，取100 μL细胞悬液加入铺胶的上室中，下室加600 μL含20% FBS的DEME 作为趋化液，每组平行设3个小室。孵育36 h，棉签擦去滤膜内表面未穿过的细胞，多聚甲醛固定15 min，外表面用结晶紫染色20 min，200倍倒置相差显微镜下观察，每个小室随机选取10个视野照相并计数细胞数，取平均值。迁移实验无Matrigel基质胶包被，余同侵袭实验。

1.3.5 Western blot法检测蛋白表达 蛋白提取RIPA改良试剂提取组织及细胞总蛋白，50 g/L聚丙稀酰胺凝胶中电泳后将蛋白电转移至硝酸纤维膜上，脱脂奶粉50 g/L封闭1 h，加入一抗(1∶1 000稀释)4 ℃过夜，TBST冲洗3次，每次10 min，之后加入二抗(1∶2 000稀释)室温孵育2 h，TBST冲洗3次，每次10 min，暗室曝光。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 UPF1在肝癌组织和细胞系中的表达

qRT-PCR检测结果显示，肝癌组织中UPF1表达显著低于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.01，图1A)。进一步检测UPF1在肝癌细胞系中的表达，结果显示，UPF1在人肝细胞LO2呈高表达，在人肝癌细胞株HepG2、Hep3B、SMCC7721、MHCC-97H、MHCC-97L细胞呈低表达，与LO2细胞表达相比，差异均有统计学意义(其中SMCC7721：P=0.0151，HepG2、Hep3B、、MHCC-97H、MHCC-97L均P<0.01，图1B)。

图1 UPF1在HCC组织和细胞系中的表达 A：与癌旁组织比较，UPF1在HCC组织中低表达；B：与永生化肝细胞LO2相比，UPF1在HCC各细胞系中表达明显降低(与LO2组比较，**P<0.01, *P<0.05)

2.2 转染UPF1过表达质粒对肝癌细胞中UPF1 mRNA和蛋白表达的影响

选取UPF1表达最低的HepG2、MHCC-97H两株细胞进行质粒转染，48 h后提取细胞蛋白和RNA检测。qRT-PCR结果显示，过表达质粒转染组UPF1明显高于阴性对照组(HepG2组：P=0.0239，MHCC-97H组：P=0.0170，图2A)；Western blot检测转染后HepG2、MHCC-97H细胞中UPF1蛋白水平表达，结果显示过表达质粒转染组UPF1蛋白表达明显高于阴性对照组(HepG2组P=0.0031，MHCC-97H组P=0.0000，图2B)。以上结果提示UPF1过表达质粒有效提高肝癌细胞内UPF1的表达水平。

图2 转染UPF1过表达质粒后肝癌细胞中UPF1 mRNA和蛋白表达情况 A：qRT-PCR结果显示，与对照组相比，UPF1过表达组UPF1 mRNA水平明显上调，*P<0.05；B：Western blot结果显示，与对照组相比，UPF1过表达组UPF1蛋白表达明显升高

2.3 过表达UPF1对肝癌细胞增殖能力的影响

取96孔板转染后的HepG2、MHCC-97H细胞，分为对照组及UPF1转染组， 24、48、72、96 h进行MTT检测结果显示，与对照组相比，随着转染时间的延长，UPF1转染组细胞的吸光度值持续低于对照组，其中转染后96 h差异最明显(HepG2组：P<0.0001，MHCC-97H组：P=0.0002，图3A)。平板克隆形成实验结果显示，UPF1转染组形成的细胞克隆较小，且数量较对照组明显降低，差异有统计学意义(HepG2组：P=0.0070，MHCC-97H组：P=0.0098，图3B)。以上结果提示，过表达UPF1抑制肝癌细胞的增殖能力。

图3 转染UPF1过表达质粒对肝癌细胞增殖能力的影响 A：MTT结果显示过表达UPF1抑制肝癌细胞增殖，96 h细胞吸光度降低最显著， **P<0.01； B：克隆形成结果(放大倍数：5×)，显示过表达UPF1抑制肝癌细胞克隆形成能力，**P<0.01

2.4 过表达UPF1对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响

取24孔板转染后的HepG2、MHCC-97H细胞进行Transwell侵袭及迁移实验，分为对照及UPF1转染组，结果显示，两株细胞UPF1转染组侵袭(HepG2组：P=0.0005，MHCC-97H组：P<0.0001，图4A)和迁移(HepG2组：P=0.0003，MHCC-97H组：P<0.0001，图4B)细胞数均明显低于对照组。

图4 过表达UPF1对肝癌细胞侵袭及迁移能力的影响 A：Transwell迁移实验(放大倍数：10×)，与对照组相比，过表达UPF1抑制肝癌细胞迁移能力，**P<0.01；B：Transwell侵袭实验(放大倍数：10×)，与对照组相比，过表达UPF1抑制肝癌细胞侵袭能力，**P <0.01

2.5 过表达UPF1对肝癌细胞EMT的影响

Western blot与qRT-PCR分别检测EMT标志物E-cadherin、N-cadherin及Vimentin 蛋白及mRNA 表达水平。取转染后的HepG2、MHCC-97H细胞进行实验，分组同前。结果显示，与对照组相比，两株细胞UPF1转染组E-cadherin 蛋白及mRNA表达均上调，而N-cadherin及Vimentin 蛋白及mRNA 表达均降低，差异有统计学意义(图5)。

图5 过表达UPF1对肝癌细胞EMT标志物表达的影响 A：Western blot检测过表达UPF1后EMT标志物蛋白水平变化；B：qRT-PCR检测过表达UPF1后EMT标志物mRNA水平变化，*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

真核细胞正常生理过程中会发生错误剪接、移码、插入等基因突变，产生的转录产物含有提前终止密码子(premature termination codon, PTC)，进而翻译成无生物活性或毒害性蛋白[8-9]。NMD在此过程中发挥重要的作用，其可以选择性地降解PTC，避免产生对正常生理功能有害的蛋白[10-11]。因此，NMD过程被称为真核细胞的监视器。NMD的发生主要由 UPF1、UPF2、UPF3、Y14、 SMG1、SMG5、SMG6、SMG7 等多种多肽发挥作用，其中UPF1是NMD过程中最关键的因子之一[12-15]。已有研究发现，UPF1在缺氧、营养缺乏、活性氧增加等影响下表达下调，NMD过程被抑制[16-18]。而缺氧、营养缺乏、活性氧增加等是肿瘤细胞生长过程中常见的情况，推测肿瘤细胞UPF1表达下调，NMD过程被抑制，导致肿瘤细胞逃避NMD监视，更易适应上述环境，从而促进肿瘤细胞发生发展。新近研究发现，UPF1作为一种抑癌基因，参与多种肿瘤的进展[19-22]。但是，UPF1与HCC的关系尚不明确，UPF1对HCC生物学特征的影响亦不清楚。为此，我们首先从组织及细胞水平两方面检测UPF1的表达，发现HCC组织及细胞系中UPF1表达均明显下降，说明HCC中UPF1表达下调，NMD过程受到抑制。

为进一步探讨UPF1对HCC细胞生长及恶性进展的关系，我们选择UPF1表达最低的两株人肝癌细胞HepG2和MHCC-97H，通过设计UPF1过表达质粒，体外分别转染HepG2和MHCC-97H，进而检测UPF1过表达对人肝癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响。通过研究发现，UPF1过表达可抑制人肝癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力，说明UPF1抑制人肝癌细胞生长及远处转移。

上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是癌细胞远处转移的必要步骤，EMT过程中上皮细胞失去极性和细胞粘附能力等上皮细胞本身的特征，转而获得侵袭及迁移等间充质细胞特征，在上述过程中，E-cadherin功能的丧失，N-cadherin、vimentin表达上调，上调EMT相关转录因子高表达，从而促使癌细胞侵袭转移[23-25]。在上述研究的基础上，我们采用Western blot及qRT-PCR从蛋白及mRNA 两方面研究人肝癌细胞的EMT特性，结果显示，UPF1过表达质粒转染后的人肝癌细胞其E-cadherin表达上调，而N-cadherin、vimentin表达下调，提示UPF1可抑制肝癌细胞EMT过程，由此我们推测，UPF1可能通过抑制肝癌EMT过程而阻止肝癌远处转移。而UPF1对EMT下游转录因子的影响以及抑制EMT过程的具体作用机制我们将在以后的研究中进一步探究。

肝癌治疗和预防仍是临床的难点，寻找有效的治疗靶点，提高肝癌患者的预后至关重要[26]。基于本研究，肝癌组织及细胞系中UPF1表达下调，转染UPF1过表达质粒抑制人肝癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力，其机制可能与UPF1抑制肿瘤细胞EMT有关。上述研究为UPF1抑制肝癌生长及转移提供了一定的理论基础，使其有望成为肝癌治疗中的新靶点，而UPF1抑制肝癌恶性生物学特征的具体机制有待进一步研究。