范文洁 陈象逊 周梦熙 罗薇薇 杨 林

胃癌是全球第5位常见肿瘤，也是造成癌症死亡的第2位病因。在我国，胃癌的发病率和死亡率均居第2位，每年新增病例多达40万，已经成为威胁民众健康的重大疾病之一。由于起病隐匿，多数患者在确诊时已处于疾病晚期，治疗效果多不理想。研究表明晚期或转移性胃癌患者的中位生存期不足1年。由此可见，深入研究胃癌发生发展机制以及寻找潜在的防治靶标具有重要的理论与实际意义。类RAS激活物2(RAS protein activator like 2,RASAL2)是一种Ras-GTP酶活化蛋白(RasGTPase-activating protein,RasGAP)，隶属于SynGAP家族，于1998年首次在前列腺癌中发现，基因定位于人类1号染色体长臂1q24-25。RASAL2参与了胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌等多种肿瘤的发生发展过程。然而，RASAL2是否参与胃癌发病以及影响胃癌患者预后尚无报道。因此，本研究基于生物信息学，利用Oncomine、GEPIA、cBioPortal等肿瘤数据库综合分析RASAL2基因在胃癌中的表达、变异及其与预后的关系，并通过体外实验验证RASAL2在胃癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用，以期为后续研究提供线索，也为胃癌的防治提供潜在分子靶标。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃癌细胞株MGC-803购自中国科学院上海细胞生物学研究所。RPMI 1640培养基、0.25%胰酶、胎牛血清均购自Gibco公司。CCK-8试剂盒购自APExBIO公司。LipofectamineRNAiMAX购自Thermo Fisher Scientific公司。RASAL2-siRNA购自上海拓然生物科技有限公司，序列为：正义链5’-GCAAGAUCAUCAACUCUUAdTdT-3’，反义链5’-UAAGAGUUGAUGAUCUUGCdTdT-3’，按说明书以50 μL RNAase-free HO/nmolsiRNA溶解为20 μM储存液，置于-20 ℃冻存待用。RASAL2抗体购自Santa Cruz公司，GAPDH抗体购自Servicebio公司。Transwell小室(24孔)、Matrigel基质胶购自SIGMA公司。

1.2 生物信息学分析 使用Oncomine数据库检索RASAL2在不同组织肿瘤中的基因表达情况。GEPIA数据库验证RASAL2在胃癌中的表达。通过Kaplan-Meier Plotter数据库进行生存分析，以四分位数，将患者分为高表达组和低表达组，并按照性别、分化程度及分期进行总生存率及亚组生存分析。通过cBioPortal数据库分析RASAL2在胃癌患者中的变异情况及其与生存预后间的关系。

1.3 细胞培养 胃癌MGC-803细胞培养于含10%胎牛血清和1%双抗(青霉素、链霉素)的RPMI 1640培养基，置于37℃、5%CO恒温培养箱中培养。

1.4 细胞增殖检测 取对数生长期胃癌MGC-803细胞以5×10个/孔接种于96孔板，待细胞融合至60%左右时进行转染。实验设置阴性对照组与RASAL2沉默组，分别使用与所有基因均无同源性序列的non-target siRNA或RASAL2-siRNA转染MGC-803细胞。以250 μL无血清培养基OptiMEM稀释5 μL siRNA，250 μL无血清培养基OptiMEM稀释5 μL Lipofectamine RNA iMAX，混匀室温孵育5 min；将转染试剂与siRNA稀释液混合，室温静置20 min；将转染复合物按每孔50 μL加入至96孔板中，以无血清培养基RPMI 1640将每孔终体积补至100 μL；转染6 h后更换新鲜培养基，置于37 ℃、5% CO恒温培养箱中继续培养。设置3个时间点：24 、48 及72小时，于各时间点前2 h加入10 μL CCK-8试剂，继续培养2 h，用酶标仪于450 nm波长下测定各孔吸光度值。

1.5 细胞划痕实验 取1×10个胃癌MGC-803细胞接种于6孔板中，待细胞密度达70%～80%进行转染，继续培养至细胞长满单层，用灭菌的10 μL枪头沿培养板底部划线，无血清培养基洗去悬浮细胞，用无血清培养基继续培养24 h，分别在0、24 小时置于倒置显微镜下观察拍照，Image J软件测量各组划痕面积，细胞迁移能力以损伤修复百分比表示。

1.6 细胞侵袭实验 将Matrigel基质胶铺于Transwell小室上室，37 ℃孵育1 h。收集转染48 h后的各组胃癌MGC-803细胞，以无血清培养基重悬至5×10/mL，接种细胞于Transwell上室，将含10%胎牛血清培养基加入Transwell下室，继续培养24 h后取出小室。擦除小室表面细胞及基质胶，4%多聚甲醛固定10 min，结晶紫染色后在显微镜下拍照计数，取细胞数平均值评估细胞侵袭能力。

1.7 Western blot 细胞转染siRNA 24 h后，以RIPA裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。按每孔20 μg上样，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳后转PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗(RASAL2 1∶500，GAPDH 1∶1 000)4℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，最后使用ECL化学发光试剂显影。

2 结果

2.1 RASAL2在胃癌组织中表达增加 通过Oncomine数据库共检索到RASAL2相关的肿瘤研究332项、涉及样本数31 947，符合“

P

<0.001；FOLD CHANGE:2；Gene rank: 10%”条件的研究共24项，其中表达增高14项、表达降低10项，见图1A。在胃癌相关研究中，检索到的3项研究均表明RASAL2在胃癌组织中的表达高于正常组织，增高倍数分别为2.638、2.699和3.269，见表1。进一步在GEPIA数据库进行验证，结果发现，在涉及408例胃癌患者与211例对照患者的基因表达数据中，RASAL2在胃癌组织中的基因表达水平高于正常组织，差异有统计学意义(

P

<0.05)。见图1B。

表1 RASAL2在不同胃癌研究中的基因表达差异

图1 RASAL2在胃癌等常见肿瘤中的表达情况

2.2 RASAL2基因表达与胃癌患者预后分析 RASAL2高表达组总体生存率低于低表达组[风险比(

HR

)=2.28， 95%CI：1.77～2.94，

P

<0.05]，见图2A。进一步按性别、肿瘤分化程度及分期进行亚组分析，结果发现，在男性与女性胃癌患者中，RASAL2高表达组总体生存率均低于低表达组(男性：

HR

=2.4，

P

<0.05；女性：

HR

=2.73，

P

<0.05)，见图2B；按分化程度进行分层，RASAL2高表达组与低表达组在高分化和低分化胃癌患者中的总体生存率差异均无统计学意义(

P

>0.05)，但在中分化胃癌患者中，与RASAL2低表达组相比，高表达组总体生存率更低(

HR

=4.74，

P

<0.05)，见图2C；按分期进行分层，RASAL2高表达组在Ⅰ期和Ⅲ期胃癌患者中的总体生存率均低于RASAL2低表达组，且差异均有统计学意义(

P

<0.05)，其中在Ⅰ期胃癌患者中，RASAL2高表达组相对于低表达组的风险比

HR

高达6.22(

P

<0.05)，但RASAL2高表达与低表达组在Ⅱ期和Ⅳ期胃癌患者中的总体生存率差异无统计学意义(

P

>0.05)。见图2D。

图2 Kaplan-Meier Plotter数据库中RASAL2表达与

2.3 RASAL2在胃癌中的基因变异情况及其与预后的关系 在1 365例胃癌患者中，具有完整的基因突变和拷贝数变异资料的胃癌样本共计1 120例，其中78例(变异组)发生基因变异，其余为非变异组，总变异率为7%，以错义突变最为常见(28.79%)，见图3A。进一步对RASAL2基因变异与生存预后进行分析，结果发现，变异组与非变异组患者的总体生存率差异无统计学意义(

P

>0.05)，但变异组患者无病生存率更高(

P

<0.05)。见图3B。

图3 胃癌患者中RASAL2基因变异情况

2.4 沉默RASAL2对MGC-803细胞增殖的影响 转染siRNA 24 h后收集细胞蛋白进行Western blot检测，结果发现，与对照组相比，转染组细胞RASAL2蛋白表达显著降低(

P

<0.05)。进一步通过CCK-8检测细胞活力，结果表明沉默RASAL2后，细胞增殖速度较对照组显著下降(

P

<0.05)。见表2。

表2 转染后RASAL2蛋白表达及细胞活力的变化

2.5 沉默RASAL2对MGC-803细胞迁移和侵袭的影响 沉默RASAL2能显著降低MGC-803细胞迁移和侵袭能力。细胞划痕实验显示，对照组细胞24 h损伤修复面积为(79.57±5.40)%，而RASAL2沉默组为(46.50±2.49)%，两组差异有统计学意义(

t

=9.632，

P

=0.001)。而在Transwell侵袭实验中，对照组与RASAL2沉默组平均穿膜细胞数分别为(188.67±13.58)和(101.33±9.45)，抑制率为53.71%，差异有统计学意义(

t

=9.144，

P

=0.001)。见图4。

图4 MGC-803细胞细胞划痕与Transwell实验

3 讨论

RASAL2是RasGAP基因家族中的一员，广泛表达于人体各组织器官，其编码产物为一种Ras-GTP酶激活蛋白，可催化Ras-GTP水解为Ras-GDP，从而发挥对Ras蛋白活性的负性调控作用。研究发现，RASAL2可以通过ERK通路、YAP通路以及调控外泌体分泌参与胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌的发生发展，并且其表达水平与肺癌、肝癌及肾癌患者的生存预后显著相关，但RASAL2在胃癌患者中的表达及其临床价值尚无报道。本研究结果显示，RASAL2在胃癌患者中的基因表达水平明显增高，并且其表达水平与胃癌患者生存预后显著相关。在不同分期胃癌患者中，虽然Ⅱ期和Ⅳ期胃癌患者中RASAL2高表达与低表达组的总体生存率差异无统计学意义，但总体来看RASAL2对分期越早的胃癌患者的生存预测作用越显著[

HR

：6.22(Ⅰ期)>1.91(Ⅱ期)>1.6(Ⅲ期)>1.12(Ⅳ期)]。表明RASAL2不仅是胃癌患者的生存预测因子，也很可能与胃癌患者的肿瘤进展密切相关。

基因变异包括基因序列变异和基因表达变异，常见变异类型包括错义突变、移码突变、插入、缺失等，由此导致基因的结构或表达异常，在肿瘤发生和发展过程中具有重要作用。本研究结果发现，RASAL2在胃癌患者中的总体变异率为7%，其中错义突变最为常见(28.79%)，且RASAL2基因变异组的无病生存率高于非变异组，提示RASAL2基因很可能参与了胃癌的发生发展过程。

无限增殖和侵袭转移是恶性肿瘤的主要生物学行为，本研究进一步在胃癌细胞株MGC-803中对RASAL2的功能进行研究。结果表明沉默RASAL2后胃癌MGC-803细胞的增殖速度减慢，并且其迁移和侵袭能力下降，因此，从体外水平验证了RASAL2在胃癌中的作用及其生物学功能。

综上所述，本研究通过对肿瘤数据库的信息挖掘与综合分析揭示了RASAL2基因在胃癌中的表达、变异及其与生存预后的关系，并通过体外实验验证了RASAL2在胃癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用，为后续研究提供了理论及实验基础。鉴于本研究仅使用了1种胃癌细胞株(MGC-803)且所用胃癌患者数据基于转录水平，得到的结论能否推广到其他胃癌细胞株或胃癌组织尚有待于后续研究探讨。此外，本研究仅初步探讨了RASAL2在胃癌中的作用，其具体分子机制亦有待于后续研究进一步明确。