不同载体对溶藻干粉菌剂溶藻效果及稳定性能的影响*

2021-11-19王美娟吴凌云郭惠娟毛林强张文艺

工业安全与环保 2021年11期

王美娟吴凌云郭惠娟毛林强张文艺

(常州大学环境与安全工程学院江苏常州 213164)

0 引言

近年来各类水体富营养化的程度和范围不断扩大，针对由此引发的饮用水安全与生态环境恶化等问题[1-2]，在原生态微生物处理体系中，加入具有高效溶藻功能的微生物菌剂，增强水体的控藻能力，缓解水体富营养化程度，从而改善水质[3]。其中干粉菌剂能够弥补液体菌剂稳定性差、不易运输以及保存时间短等缺点，成为微生物菌剂领域研究热点。

在干粉菌剂中添加载体，有利于提高菌剂质量，使微生物细胞不易流失，并有效屏蔽外界不良环境因素。由于不同载体对菌体的承载能力与释放能力不同，选择正确的载体对干粉菌剂菌体生物量及性能起着至关重要的作用。优良载体中，活性炭具有良好的吸附性能且结构疏松透气、比表面积大、理化性质稳定，已被广泛应用于污水处理、土壤修复、给水净化等领域[4-6]，是一种良好的载体材料。玉米粉为可再生生物资源，在使用过程中体现出糊化、流变等理化性质[7]，可作为微生物菌剂载体。郭健等[8]使用了麦麸、玉米粉、木屑为复合载体制得降解氯嘧磺隆菌剂，25 ℃下保存40 d，菌剂仍能保持较高的降解效果，证实了玉米粉作为菌剂载体的可行性。小麦粉在原子力显微镜下呈现出颗粒状纳米结构形态，液化后结构多变，不但有直链与支链结构，还存在环状、糜状等结构[9]，含有丰富的蛋白质等物质，能有效吸附菌体并为其提供营养物质。稻草粉是常见的有机载体，不仅成本低廉，且环境友好不会造成二次污染。吴金男等[10]的实验表明稻草粉为吸附载体的菌剂活性较好。

本文以活性炭、玉米粉、小麦粉和稻草粉作为菌剂载体，对溶藻功能菌液体菌剂进行吸附，真空冷冻干燥以制备成干粉菌剂。通过检测干粉菌剂载体种类、复合载体比例及长时间存储过程中粉剂菌群的变化，分析不同载体对溶藻功能菌GHJ成活率、溶藻效果的影响，寻求经济易得、固化效果好的微生物载体，以期为溶藻干粉菌剂的运用及市场投入提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料1.1.1 菌种

实验所用菌种由课题组前期从太湖自然繁殖的花鲴鱼内脏(肝、肠等)筛选得到，编号为GHJ(Microbacteriumoleivorans)，于4 ℃环境中保存[11]。

1.1.2 藻种

实验藻种为铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa，FACHB-905)购自武汉水生生物所，活化后接种于BG11培养基。

1.1.3 主要试剂与仪器

(1)主要仪器：摇床、离心机、培养箱、高压蒸汽灭菌锅、真空冷冻干燥机、岛津紫外分光光度计UV-1800等。

(2)试剂：玉米粉、小麦粉、活性炭、稻草粉、牛肉膏、鱼粉蛋白胨、琼脂粉、NaCl等试剂均为分析纯或生化纯试剂。

1.1.4 培养基

细菌培养采用牛肉膏蛋白胨培养基；铜绿微囊藻培养采用BG11培养基。

1.2 实验方法

1.2.1 单一载体菌剂对菌体稳定性的影响

为了控制实验过程中的单一变量，选取体积分数为10%的蔗糖溶液作为菌剂保护剂，玉米粉、小麦粉、活性炭、稻草粉作菌剂载体，考察不同载体对菌体的存活率的影响。取100 mL经20 h发酵的GHJ菌种子液，加入5 g载体、5 mL保护剂制成105 mL液体菌剂，于120 r/min转速、25 ℃条件下培养约18 h，取1 mL液体菌剂，平板计数，记录菌剂中原有的菌体数量。剩余液体菌剂经-40 ℃～-30 ℃真空冷冻干燥48 h，制成溶藻干粉菌剂，配置成与原来液体菌剂相同体积的菌液，平板计数，计算经冷冻干燥后溶藻菌的成活率，计算公式见式(1)：

(1)

1.2.2 单一载体菌剂对溶藻效果的影响

为了考察4种载体制成的不同干粉菌剂对铜绿微囊藻的溶藻效果，取干粉菌剂1 g加入1 mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)进行活化，将活化24 h的菌剂按菌藻体积比为1∶12投加至相应体积的铜绿微囊藻中。采用乙醇提取分光光度计法每24 h测定其叶绿素a(Chla)含量并计算溶藻率(见式(2))，通过Chla含量变化表征溶藻效果。

(2)

1.2.3 溶藻菌剂的SEM图像分析

将制备好的溶藻干粉菌剂进行镀金导电处理后，使用电子扫描显微镜观察其微观结构。

1.2.4 复合载体菌剂对菌体稳定性的影响

将各类载体制成复合载体，考察复合载体对菌体存活率的影响。采用Design-expert进行响应面设计实验方案及分析。

1.2.5 存储时间对菌剂群落结构变化分析

使用单一载体制备溶藻干粉菌剂存储于真空密封的铝箔袋中，置于25 ℃、避光的环境中保存30 d，将其送往上海天昊生物科技有限公司完成高通量测序，分析长时间存储对干粉菌剂群落结构的影响。

1.2.6 存储时间对菌体稳定性的影响

使用PBS缓冲溶液将保存了15 d与30 d后的溶藻干粉菌剂进行活化，梯度稀释、平板计数保存了15 d与30 d后的干粉菌剂活菌数，分析其存储稳定性。

1.2.7 存储时间对菌剂溶藻效果的影响

使用PBS缓冲溶液将保存了15 d与30 d后的溶藻干粉菌剂进行活化，以菌藻体积比为1∶12投加铜绿微囊藻液中，每24 h取样测定其Chla含量并计算溶藻率，分析存储时间对菌剂溶藻效果的影响。

2 结果与讨论

2.1 溶藻菌剂的SEM图像分析

电子显微镜下观察溶藻干粉菌剂的微观形态如图1所示。添加玉米粉后，由于玉米粉分子间靠氢键结合而排列紧密，间隙很小，即使是水分子也难以渗透进入玉米粉分子，菌体的吸附量有限(图1(a))；小麦粉加入菌剂中后，小麦粉呈现球状，粉末细腻，介质表面承载了大量菌体，不难看出小麦粉对GHJ菌的吸附能力较好(图1(b))；活性炭的微孔结构发达，功能菌不仅能附着在活性炭的表面，其微孔结构中也能附着大量菌体，是十分理想的菌剂载体(图1(c))；稻草粉做载体时，稻草粉表面凹凸不平，纤维结构较为细长，载体结构几乎为一个整体，GHJ菌体分散地附着在其表面，附着量较少(图1(d))。

(a)玉米粉菌剂

2.2 单一载体菌剂对溶藻菌体稳定性的影响

不同载体对菌体活菌数和成活率的影响如图2所示。从图2可以看到：活性炭作为载体供溶藻菌GHJ附着时的溶藻菌GHJ成活率最高，为145.53%；稻草粉做载体时成活率仅为55.95%；玉米粉载体GHJ菌成活率达到了72.86%；小麦粉作为载体使得溶藻菌GHJ成活率达到134.69%。其中，活性炭菌剂与小麦粉菌剂活菌数分别为1.44×109CFU/mL、1.65×109CFU/mL，均高于冷冻干燥前液体菌剂中的活菌数。

图2 不同载体对菌体活菌数和成活率的影响

4种载体中，活性炭的多孔结构吸附效果显著，在冷冻干燥过程中，蔗糖保护剂的作用下，溶藻菌GHJ成活率效果最好。菌体能够快速附着在活性炭的吸附点位，在溶解菌剂时，活菌体能容易地从活性炭中释放出来，这可能与活性炭发达的微孔结构有关，具有空腔与通道结构，更适合菌体的吸附、存活与增殖。边雪等[12]研究证明YBN13菌株可选用活性炭做载体制备菌剂，其菌剂活菌数能达到《农用微生物菌剂》(GB 20287—2006)中的活菌数目要求。可以将活性炭作为后续研究中GHJ菌株的附着载体，使得菌剂成活率大大增加。

2.3 单一载体菌剂对溶藻效果的影响

选取玉米粉、小麦粉、活性炭与稻草粉做单一载体制成干粉菌剂后投加到铜绿微囊藻液中，粉剂的控藻效果如图3所示。空白组Chla含量在实验范围内保持平稳增长趋势，玉米粉实验组Chla含量在溶藻的第2 d、第4 d有微小上升的趋势，其余都整体呈下降趋势，溶藻率第8 d溶藻率为86.25%，Chla含量为9.28 mg/m3，说明溶藻菌GHJ在玉米粉做载体经冷冻干燥制成干粉菌剂后溶藻菌的抑藻效果较好。

图3 单一载体对溶藻效果的影响

小麦粉实验组Chla含量在溶藻的前2 d，Chla含量下降的并不明显，还有略微上升的趋势，可能是溶藻菌并未完全活化或是活化后受环境影响较大，溶藻活性较弱。溶藻实验进行到第5 d Chla含量下降较为明显，溶藻率上升较大，第8 d溶藻率为92.04%，Chla含量为5.37 mg/m3，溶藻效果显著。

当活性炭作为单一载体制备干粉菌剂时，实验组的Chla含量在溶藻前4 d呈下降趋势，第5 d是略有上升，然后继续下降直至第8 d，此时溶藻率为92.23%，Chla含量为5.24 mg/m3，溶藻反应基本完成，由于在溶藻过程中同时也存在藻类生长的情况，因而存在溶藻过程中Chla含量短暂上升的现象。

稻草粉做载体制成干粉菌剂后投加到铜绿微囊藻液中，实验组Chla含量在溶藻第2 d、第4 d略有上升，原因可能为溶藻菌的溶藻速率低于铜绿微囊藻的生长速率，从而导致Chla含量上升。第5 d后Chla含量快速下降，第8 d溶藻率为86.18%，Chla含量为9.33 mg/m3。

2.4 复合载体对菌体成活率的影响

将各类载体制成复合菌剂，运用响应面法考察复合载体对菌体存活率的影响。实验设计4个实验因素(A，玉米粉含量；B，活性炭含量；C，小麦粉含量；D，稻草粉含量)，根据预实验结果确定每个因素5个水平，共进行15组实验。实验设计因素及水平见表1。每组复合载体制备的冷冻干燥前、后菌剂如图4—图5所示。

表1 复合载体实验方案设计(实际)

图4 冷冻干燥前液体菌剂

图5 冷冻干燥48 h干粉菌剂

以菌体成活率为响应值，通过CCD设计的玉米粉含量、活性炭含量、小麦粉含量、稻草粉含量4因素5水平实验，得到15组实验数据如表2所示。

表2 复合载体实验数据

成活率最高为单一活性炭载体菌剂140.22%，最低为单一稻草粉菌剂55.94%，各种复合载体菌剂菌体的成活率范围为57.82%～137.81%。由此可见：复合载体制成的干粉菌剂中溶藻菌成活率均低于单独投加活性炭做载体时干粉菌剂的溶藻菌成活率，推测原因为小麦粉与玉米粉颗粒细小，可大面积接触溶藻菌株，但与微孔结构发达的活性炭相比，比表面积小于活性炭；此外溶藻细菌GHJ难以附着在纤维丰富的稻草粉载体上，冷冻干燥后菌体损失严重。在复合载体中，活性炭所占比例减少，因此粉剂中功能菌活菌数减少，成活率降低。

使用Design expert对表2进行多元回归分析，得到回归方程：

Y=72.93A+132.00B+140.22C+55.94D-43.37AB-12.05AC-26.49AD+6.77BC+2.81BD-22.23CD+333.10ABC+401.35ABD+189.46ACD+574.57BCD

回归系数模型及方差分析结果见表3。

由表3可知：回归系数模型P=0.002 0(P<0.01)，表明回归模型显著；相关系数R2=0.974 9(R2>0.9)，表明模型与实际的拟合度较好，该回归模型可以较好地分析预测复合载体制备干粉菌剂菌体的存活情况。

表3 回归系数模型及方差分析结果

2.5 溶藻干粉菌剂的存储稳定性2.5.1 存储时间对菌体稳定性的影响

菌剂的存储稳定性将直接影响菌剂的使用效果，在常温避光、真空密闭的环境中保存15、30 d后的4种菌剂菌体成活率如图6所示。可以发现，4种菌剂中活菌数随着存储时间的延长而减少，15 d时稻草粉菌剂、玉米粉菌剂、小麦粉菌剂以及活性炭菌剂的成活率分别为80.52%、84.21%、83.83%、78.24%，活性炭菌剂的成活率均低于其余3种载体菌剂，主要是其余3种载体材料均为生物材料，富含纤维、蛋白质等有机物，能够为溶藻菌提供碳源、氮源等能量以维持菌株自身生长与繁殖。而存储30 d后，活性炭菌剂的活菌数仍有23.23×108CFU/mL，成活率为63.47%，高于稻草粉菌剂成活率42.01%、玉米粉菌剂成活率39.17%与小麦粉菌剂成活率57.42%，推测在常温条件下功能菌的新陈代谢较快，此时稻草粉、玉米粉、小麦粉中的营养物质几乎被消耗殆尽，菌株分泌某些代谢产物引起生存环境发生变化，直至超过菌体的耐受范围菌体逐渐死亡，同时杂菌的污染与功能菌株竞争养分也会使得溶藻菌GHJ活菌数减少。王晔[13]也通过实验证明以麦麸为载体的菌剂保存10 d后活菌数快速下降的原因是菌体利用麦麸产生了碱性物质，使得菌剂环境的pH值增加从而导致菌体大量死亡。

2.5.2 存储时间对菌剂溶藻效果的影响

图7与图8分别表示了不同载体菌剂经15、30 d保存后处理铜绿微囊藻的溶藻效果。其中以活性炭为载体的溶藻菌剂由于其吸水性强，制备成菌剂后初始活菌数较多，保存15 d与30 d后溶藻率分别能达到80.05%、71.37%。以稻草粉、玉米粉和小麦粉为载体的菌剂在保存时间为15 d时仍具有良好的溶藻效果，在8 d的溶藻过程中基本可以将铜绿微囊藻去除75%以上，但随着保存时间延长至30 d，这3种材料为载体的菌剂溶藻效果也随之下降。总的来说，经过一段保存时间的溶藻干粉菌剂与新制成的菌剂相比，溶藻率均有所下降，其原因是随着保存时间的增加4种载体菌剂的活菌数减少，菌剂受杂菌污染后菌效降低。

图6 存储时间对活菌数和成活率的影响

图7 15 d保存下对溶藻效果的影响

图8 30 d保存下对溶藻效果的影响

综上所述，当活性炭作为菌剂载体时，存储30 d后溶藻干粉菌剂不仅成活率最高，溶藻效果也最好，活性炭比表面积大能够提供一个合适的环境供菌株吸附与固定，同时可以给予一定的碳源满足菌株生命活动以维持较好的活性。

2.6 干粉菌剂群落结构变化分析2.6.1 OTU聚类分析

溶藻菌GHJ制成干粉菌剂，保存在常温避光的环境中30 d，此过程通常伴随着功能菌菌体的死亡与杂菌的污染、增殖等问题，导致干粉菌剂中菌群结构发生变化。基于高通量测序，对不同载体成份的干粉菌剂菌种多样性进行分析，计算菌群丰富度指数，辨别操作分类单元(OTU)，将大于97%的序列相似度划为同一个OTU，逐条和数据库中基因序列比对。

在以稻草粉做载体的干粉菌剂中，菌剂中的OTU共6种，分布于6个门、6个菌纲、6个菌目、6个菌科、6个菌数和4个菌种间；在以玉米粉做载体的干粉菌剂中，菌剂中的OTU共5种，分布于5个门、5个菌纲、5个菌目、5个菌科、5个菌数和5个菌种间；在以小麦粉做载体的干粉菌剂中，菌剂中的OTU共15种，分布于13个门、13个菌纲、12个菌目、13个菌科、11个菌数和11个菌种间；在以活性炭做载体的干粉菌剂中，菌剂中的OTU共3种，分布于3个门、3个菌纲、3个菌目、3个菌科、3个菌数和3个菌种间。

2.6.2 多样性指数分析

干粉菌剂样本中的丰富度和多样性用Alpha多样性指数进行评估。每个样品的覆盖率、SACE指数、Shannon指数以及Simpson指数可以评估样品中物种的测序深度、丰富度、多样性[14]。由表4可知：4种载体制备的干粉菌剂样品种微生物的覆盖率均高于90%，样品序列在高通量测序时基本都已测出，说明此次高通量测序结果可以反映样品的真实情况。SACE数值越大，代表物种总数越多，因此可判定小麦粉做载体时，物种最多，稻草粉、玉米粉次之，活性炭最少，说明活性炭菌剂在30 d的保存过程中，受杂菌污染程度最小。Shannon指数用来描述种群的个体出现的紊乱和不确定性，Shannon值越大，物种多样性就越高。活性炭菌剂中Shannon指数明显低于其他3种载体菌剂，表明活性炭中细菌群落多样性低于稻草粉、玉米粉和小麦粉。Simpson指数用来估算样本中微生物的多样性，指随机取样两个个体属于不同种的概率，Simpson值越大，群落多样性越低。4种载体中Simpson值由大到小为活性炭>玉米粉>稻草粉>小麦粉，也直接证明了当活性炭做载体供溶藻菌附着后，菌剂保存能力较好，干粉菌剂中菌群结构变化不大，不易变质。

表4 Alpha多样性分析

2.6.3 干粉菌剂微生物群落结构门与属的变化

4种不同载体制备的菌剂经30 d存储后菌群的组成(门水平)如图9所示。从图9中可以看出：放线菌门(Actinobacteria)为此次溶藻干粉菌剂中的优势类群，第二大优势类群为厚壁菌门(Firmicutes)。其中，在稻草粉做载体的菌剂中，放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度为85.71%，厚壁菌门(Firmicutes)为14.28%，变形菌门(Proteobacteria)占0.01%。玉米粉做载体的干粉菌剂群落组成中，Actinobacteria占89.88%，Firmicutes占10.06%，Proteobacteria占0.06%。小麦粉做载体的干粉菌剂群落组成中，Actinobacteria占8.45%，Firmicutes占79.85%，Proteobacteria占10.36%。Unassigned占0.74%，Cyanobacteria/chloroplast占0.6%。活性炭做载体的干粉菌剂群落组成中Actinobacteria占90.69%，Firmicutes占9.29%，Proteobacteria占0.02%。由此推断，当干粉菌剂在常温避光情况下长时间存储后，小麦粉由于吸水性强，存储时间越长，干粉菌剂中水分越大，易生霉变质，被其他杂菌污染。

图9 4种载体菌剂微生物群落结构分布图(门水平)

不同载体种类溶藻干粉菌剂的细菌类群属(属水平)变化差异见图10。溶藻干粉菌剂中功能菌GHJ鉴定为Microbacteriumoleivorans，属于微杆菌属(Microbacteriumsp.)。4种菌剂中Microbacterium为菌剂中的优势种，在稻草粉菌剂、活性炭菌剂及玉米粉菌剂中含量最丰富，而小麦粉菌剂中功能菌所在属的相对丰度却很低，Bacillus的丰度较高，为小麦粉菌剂最主要的优势类群。此外小麦粉菌剂中还存在Comamonas、Pseudomonas、Acinetobacter、Streptophyta等类群，表明小麦粉菌剂受杂菌污染程度较重，溶藻功能菌生长受到限制。