张 伟，孙亦钊，张娟娟，黄妍妍，王世林，陈 林，尹震花

（黄河科技学院·郑州市天然产物合成生物学重点实验室，河南 郑州 450063）

茵栀黄制剂包括口服液、颗粒、软胶囊、泡腾片、胶囊等剂型，是由茵陈、栀子、黄芩、金银花4味中药的提取物制成的常用中成药制剂，由张仲景传统中医名方“茵陈蒿汤”加减药味组方[1]，具有清热解毒、利湿退黄功效，用于治疗肝胆湿热所致黄疸，症见面目悉黄、胸胁胀痛、恶心呕吐、小便黄赤及急、慢性肝炎见上述证候者[2]，临床用于治疗新生儿生理性和病理性黄疸、黄疸型肝炎等疗效较好[3-4]。方中，茵陈主要含有绿原酸、香豆精、咖啡酸等成分，为治疗肝胆疾病的主要有效成分[5]；栀子主要有效成分为环烯醚萜苷类化合物，如栀子苷、有机酸类等[6]；黄芩主要有效成分为黄酮类化合物，如黄芩苷和黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素[7]；金银花主要有效成分为有机酸类、黄酮类、皂苷类、鞣质等化学成分[8]。茵栀黄制剂现行质量标准为2015年版《中国药典（一部）》收载的茵陈、栀子、黄芩、金银花提取物的质量标准，分别以对羟基苯乙酮、栀子苷、黄芩苷、绿原酸为指标进行质量控制。目前，主要对茵栀黄颗粒和口服液中的有效成分[9-14]进行研究，对比分析缺少茵栀黄胶囊制剂中有效成分及不同制剂中的有效成分含量。本研究中采用高效液相色谱（HPLC）法测定茵栀黄3种制剂颗粒剂、口服液、胶囊剂中4种有效成分绿原酸、黄芩苷、栀子苷、木犀草素的含量，并比较各制剂中的含量差异，为深入研究茵栀黄制剂的质量标准提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waterse2695型高效液相色谱仪（美国Water公司）；AG285型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度为十万分之一）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为500W，频率为40kHz）。

1.2 试药

绿原酸对照品（批号为RP190531），木犀草素对照品（批号为RP181106），黄芩苷对照品（批号为RP190624），栀子苷对照品（批号为RP190629），均购自成都麦德生科技有限公司，规格为每支20 mg，纯度≥98.00%；茵栀黄口服液[北京新华润高科天然药物有限公司，批号为191014，规格为每支10mL（含黄芩苷0.4 g）]；茵栀黄胶囊（四川百利药业有限公司，批号为191102，规格为每粒0.33 g）；茵栀黄颗粒（鲁南厚普制药有限公司，批号为09190461，规格为每袋3 g）；乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技＜中国＞有限公司）；甲醇、甲酸（均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：XterraMSC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～10min时10%B～30%B，10～25 min时30%B）；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：30℃；进样量：10μL。在此色谱条件下，各成分色谱峰基线分离，与相邻色谱峰的分离度大于1.5。色谱图见图1。

图1 系统适用性试验高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of the system suitability test

2.2 溶液制备

取绿原酸、栀子苷、黄芩苷、木犀草素对照品各适量，精密称定，分别加甲醇制成质量浓度为101.2，105.2，404.0，85.2μg/mL的对照品贮备液；精密量取上述对照品贮备液各适量，置25 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得质量浓度分别为20.24，29.46，48.48，11.93μg/mL的混合对照品溶液。取茵栀黄胶囊内容物30.78mg、茵栀黄颗粒46.36mg，精密称定，精密量取茵栀黄口服液80μL，分别置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率为300 W，频率为40 kHz）20 min，冷却至室温，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察[2，10]与检测限、定量限确定：分别精密吸取2.2项下绿原酸、栀子苷、木犀草素对照品贮备液各适量，置容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得质量浓度分别为25.30，31.56，10.65μg/mL的对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0μL，精密吸取黄芩苷对照品贮备液1，2，4，8，12，16μL，分别注入液相色谱仪，按2.1项下色谱条件进样测定，以峰面积（Y）为纵坐标、进样量（X，μg）为横坐标绘制标准曲线。用甲醇逐级多步稀释对照品溶液，并逐一进样，以信噪比（S/N）为3时的含量为检测限，以S/N为10的含量为定量限。结果见表1。

精密度试验：取2.2项下混合对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果见表1，表明仪器精密度良好。

重复性试验：取茵栀黄颗粒，依法制备供试品溶液，共6份，按2.1项下色谱条件进样测定。结果见表1，表明方法重复性良好。

稳定性试验：取茵栀黄颗，依法制备供试品溶液，分别于室温下放置0，4，8，12，16，24 h时按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果见表1，表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定。

表1 茵栀黄制剂中4种有效成分方法学考察结果Tab.1 Results of methodological investigation of four active ingredients in Yinzhihuang preparations

加样回收试验：取已知含量的茵栀黄颗粒，研细，每份0.4 mg，精密称定，共6份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入适量按2.2项下方法新制备的混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表2。

表2 茵栀黄颗粒中4种有效成分加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test of four active ingredients in Yinzhihuang Granule（n=6）

2.4 样品含量测定

取茵栀黄颗粒、胶囊、口服液各适量，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定3次，并计算4种有效成分的含量。结果见表3。

表3 3批样品中4种有效成分含量测定结果（n=3）Tab.3 Results of content determination of four active ingredients in three batches of samples（n=3）

3 讨论

3.1 流动相选择

参考文献[15-16]，以0.1%甲酸溶液-乙腈为流动相，比较了不同配比流动相对各色谱峰分离度、出峰时间、峰形等的影响。按2.1项下梯度洗脱程序，绿原酸、栀子苷、黄芩苷、木犀草素的色谱峰峰形良好，出峰时间短，基线平稳，柱压低。故最终选择0.1%甲酸溶液-乙腈为流动相。

3.2 检测波长选择

2015年版《中国药典（一部）》中规定绿原酸、栀子苷、黄芩苷、木犀草素检测波长分别为325，238，280，360 nm。于238，254，325，360 nm波长处供试品溶液均可检测到绿原酸、栀子苷、黄芩苷、木犀草素，但在254 nm波长处4种有效成分均有较强吸收，且峰形良好，基线平稳，故最终选择254 nm为检测波长。

3.3 含量测定结果分析

2015年版《中国药典（一部）》中规定每1 mL茵栀黄口服液中含黄芩苷34～46 mg，栀子苷不得少于0.80 mg；每粒茵栀黄胶囊中含黄芩苷120.0～147.0 mg，栀子苷不得少于1.6 mg，绿原酸不得少于1.2 mg；每袋茵栀黄颗粒中含黄芩苷180～220 mg，栀子苷不得少于3.0 mg，绿原酸不得少于1.8 mg[2]。本研究中茵栀黄口服液、颗粒、胶囊中绿原酸和栀子苷的含量均符合规定，而黄芩苷的含量略高。这可能与提取方法、检测条件、标准品来源等不同有关。另外，茵栀黄制剂是由4种提取物组成，不同含量组合制成的制剂，测定每种制剂中相应化合物的含量与测定其中的含量略有不同，也会与本研究结果有一定误差。

3.4 方法评价

该方法操作简单，灵敏度高，重复性好，稳定可靠，可用于同时测定茵栀黄颗粒、口服液、胶囊中绿原酸、栀子苷、黄芩苷、木犀草素4种有效成分的含量，同时可为后续研究茵栀黄制剂中的有效活性成分提供参考。