贾首前，王莉芳，冯润东，张 丽

（陕西省食品药品监督检验研究院，陕西 西安 710065）

长春西汀由小蔓长春花中分离得到的一种吲哚类生物碱长春胺结构改造而来，生物活性更高，毒副作用更小。其最早由匈牙利的Gedeon Richter药物公司研发，并于1978年以商品名Cavinton上市，脂溶性高，呈现pH酸性依赖，易透过血脑屏障[1]，用于治疗脑血管相关疾病认知障碍[2]。目前，长春西汀注射剂的批准文号共59个，其中注射用长春西汀37个，长春西汀注射液22个。2020年，国家抽验评价该品种现行标准中既采用家兔热原法，又采用细菌内毒素法检查热原物质，发现热原限值相差5倍，细菌内毒素限值相差8倍，且在热原检查过程中出现家兔体温降低，易出现假阴性结果。长春西汀注射液/注射用长春西汀（以下称为长春西汀注射剂）制备过程中使用了枸橼酸、维生素C、甘露醇/山梨醇、L-酒石酸等多种辅料，辅料内毒素的控制情况直接影响长春西汀注射剂的热原物质。为评估各厂家热原物质的整体控制情况，参照2015年版《中国药典（四部）》中细菌内毒素检查凝胶法[3]及文献[4-9]开展长春西汀注射剂细菌内毒素检查法的研究，评估内毒素检查法替代热原检查法的可行性，同时建立细菌内毒素的质量控制标准。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

TAL-40D型试管恒温仪（湛江安度斯生物有限公司）；DHG-9245A型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；ZH-2型混旋仪（天津药典标准仪器厂）；微量移液枪（Eppendorf公司）；细菌内毒素检查用具（试验所用玻璃仪器均经250℃干烤30 min）。

1.2 试药

鲎试剂（湛江博康海洋生物有限公司，批号为2004012；湛江安度斯生物有限公司，批号为1908192；灵敏度均为0.25 EU/mL，规格均为每支0.1 mL）；细菌内毒素工作标准品（CSE，中国食品药品检定研究院，批号为150601-201784，规格为每支80 EU；细菌内毒素检查用水（BET用水，批号为1907020，规格为每支5 mL），碱性调节剂（批号为1903080，规格为每支2 mL），均购自湛江博康海洋生物有限公司；镁离子缓冲液（湛江安度斯生物有限公司，批号为2002270，规格为每支4.0 mL）；氢氧化钠（国药集团化学试剂有限公司，批号为20170105）；长春西汀注射液（遂成药业股份有限公司，批号分别为11904042，11908151，11904041；注射用长春西汀（海南通用康力制药有限公司，批号分别为11911014，11904011，11904021；云南盟生药业有限公司，批号分别为20190201，20190303，20190301；开封康诺药业有限公司，批号分别为D190263，D191091，D191083；山西普德药业有限公司，批号分别为11190502，09190302，09190601）。

2 方法与结果

2.1 供试品细菌内毒素限值确定

2015年版《中国药典（四部）》中细菌内毒素限值（L）计算公式为L=K/M。式中，K为按规定给药途径人用每千克体质量每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂K=5 Eu/（kg·h）；M为人用每千克体质量每小时最大剂量，体质量按60 kg计。参照长春西汀注射剂药品说明书，本品成人1次最大给药剂量为30 mg，则L=10.0 EU/mg。由于本品属急症心脑血管疾病用药，临床用量大，故将限值确定为计算值的1/2，即5.0 EU/mg。

2.2 供试品最大有效稀释倍数（MVD）确定

目前，市售鲎试剂灵敏度为0.50～0.03 EU/mL，按2015年版《中国药典（四部）》通则1143细菌内毒素检查法计算公式MVD=CL/λ，C=5 mg/mL，L=5.0 EU/mg，则 MVD0.50～0.03为50～833倍（0.010～0.006 mg/mL）。

2.3 鲎试剂灵敏度复核

按2015年版《中国药典（四部）》通则1143检查2个厂家灵敏度为0.5 EU/mL的鲎试剂，复核结果λc均在0.5λ～2.0λ之间，符合细菌内毒素检查要求。详见表1。

表1 鲎试剂灵敏度复核结果（EU/mL）Tab.1 Recheck results of sensitivity of limulus amebocyte lysate（EU/mL）

2.4 供试品干扰试验预试验

先将样品用BET用水溶解成5 mg/mL的样品溶液，再用BET用水和镁离子缓冲液或0.75 mol/L氢氧化钠溶液稀释成50，100，200，400，800倍的供试品溶液，记为供试品阴性对照（NPC）管，样品稀释前后的pH见表2。另制备同样稀释浓度的系列稀释液，并使每个稀释浓度的稀释液均含1.0 EU/mL（2λ）的内毒素，记为供试品阳性对照（PPC）管，使用2个厂家λ均为0.5 EU/mL的鲎试剂，每个浓度分别取0.1 mL，加入用BET用水复溶的鲎试剂管中，每个浓度做2管，同时设NC管、阳性对照（PC）管，轻轻混匀，封口，放置在（37±1）℃试管恒温仪中保温（60±2）min。结果见表3至表4。可见，使用标示灵敏度为0.5 EU/mL的2个厂家的鲎试剂，采用镁离子缓冲液调节pH后，3批（批号分别为11190502，09190302，09190601）样品在系列稀释倍数下均对细菌内毒素的试验结果存在干扰作用。由于样品均存在干扰作用，所有样品使用0.75 mol/L氢氧化钠溶液调节pH后进行预试验。结果，所有样品均对细菌内毒素的预试验结果无干扰作用，故最终选择0.75 mol/L氢氧化钠溶液调节pH。

表2 长春西汀注射剂稀释前后的p H值Tab.2 The p H value of Vinpocetine Injection before and after the dilution

表3 长春西汀注射剂细菌内毒素干扰试验预试验结果（镁离子缓冲液，鲎试剂批号为1908192）Tab.3 Pre-test results of bacterial endotoxin interfering test of Vinpocetine Injection（magnesium ion buffer，the batch number of limulus amebocyte lysate is 1908192）

表4 长春西汀注射液剂细菌内毒素干扰试验预试验结果（镁离子缓冲液，鲎试剂批号为2004012）Tab.4 Pre-test results of bacterial endotoxin interfering test of Vinpocetine Injection（magnesium ion buffer，the batch number of limulus amebocyte lysate is 2004012）

2.5 干扰试验正式试验

按2.3项下方法配制标准品系列溶液，按2.4项下方法将5 mg/mL长春西汀注射剂使用BET用水和0.75 mol/L氢氧化钠溶液制成1∶50（V/V）的溶液，同时配制1∶50（V/V）样品溶液含细菌内毒素浓度分别为2λ，1λ，0.5λ，0.25λ的系列溶液，每个浓度分别平行做2管和4管，按2015年版《中国药典（四部）》通则1143进行干扰试验。结果见表5。可见，细菌内毒素工作标准品的反应终浓度（标准品系列溶液内毒素反应终浓度Es）均在0.5λ～2.0λ之间，细菌内毒素工作标准品在长春西汀注射剂1∶50（V/V）稀释溶液中的反应终浓度（供试品含标准品系列溶液反应终浓度Et）均在0.5～2.0 Es之间，符合2015年版《中国药典（四部）》对细菌内毒素检查有效性的规定。

表5 长春西汀注射剂细菌内毒素干扰试验正式试验结果（EU/mL）Tab.5 Results of bacterial endotoxin interfereing test of Vinpocetine Injection（EU/mL）

2.6 供试品细菌内毒素检查

根据干扰试验结果，取上述15批供试品，先用BET用水制成质量浓度为5 mg/mL的溶液，再用BET用水和0.75 mol/L氢氧化钠溶液稀释成1∶50（V/V）的供试品溶液，使用2个厂家的鲎试剂（λ为0.5 EU/mL），按2015年版《中国药典（四部）》通则1143项下方法进行细菌内毒素检查，每1 mg长春西汀注射剂中含细菌内毒素的量应小于5.0 mg。结果15批供试品均为阴性，PPC管均为阳性，NC管均为阴性，PC管均为阳性，检查结果均符合规定。

3 讨论

长春西汀注射液处方工艺中均含有维生素C、甘露醇/山梨醇、L-酒石酸；注射用长春西汀处方工艺中均含有枸橼酸、甘露醇/山梨醇等多种辅料。《美国药典（42版）》[10]和《欧洲药典10.0》[11]中均未收载长春西汀注射剂的质量标准，仅有长春西汀原料药的质量标准，标准中均未涉及长春西汀的热原或细菌内毒素检查法。研究发现，高浓度的甘露醇对细菌内毒素检查存在干扰作用[12-13]，参照2018年版《英国药典》[14]中枸橼酸细菌内毒素限值（0.5 EU/mg），本试验室采用0.25 EU/mL的鲎试剂确定了枸橼酸的最大不受干扰浓度为0.5mg/mL，表明样品中高浓度的枸橼酸对细菌内毒素检查有抑制作用。镁离子缓冲液作为细菌内毒素检查的辅助剂，可消除枸橼酸盐类抗凝剂，部分会导致鲎试验反应中二价离子缺失的样品的干扰作用，在使用镁离子缓冲液和碱性调节剂调节pH过程中高浓度的样品会产生沉淀。故在开始稀释样品时使用BET用水，在最后一步使用镁离子缓冲液进行等比稀释，即可调整到合适的pH值，且无沉淀产生，与文献[8]报道一致。文献[5]报道了采用除热原处理的0.75 mol/L氢氧化钠溶液调整pH来排除干扰作用。若样品pH值过小（pH≤3.0），采用镁离子缓冲剂不能达到适宜的pH值（pH＜6.0）时，宜采用0.75 mol/L氢氧化钠溶液调整到合适的pH值再进行试验；若样品pH＞3.0，可考虑使用镁离子缓冲剂调节pH。

鲎试剂反应最适pH值为6.0～8.0，过低或过高均会干扰试验结果[6，15]。用注射用长春西汀溶解后pH值偏低，本研究中采用稀释法和中和法对长春西汀注射剂进行了细菌内毒素方法学验证，中和法建议采用0.75 mol/L氢氧化钠溶液。结果表明，长春西汀注射剂（5 mg/mL）使用2个厂家灵敏度为0.5 EU/mL的鲎试剂，并采用细菌内毒素检查法来控制其细菌内毒素含量可行。

综上所述，本研究中建立的长春西汀注射剂细菌内毒素检查法合理、可行，可替代热原检查法，消除热原检查中家兔体温降低出现的假阴性结果。建议将细菌内毒素限值统一为5.0 EU/mg。