王宇宁，樊 晖，梁克利，3

（1.辽宁省沈阳市第七人民医院，辽宁 沈阳 110000； 2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110847；3.哈尔滨商业大学，黑龙江 哈尔滨 150076）

紫苏Perilla frutescens（L.）Britt.为唇形科紫苏属1年生草本植物，又名白苏、名苏、赤苏、桂荏等，药用及食用历史悠久，是公认的药食同源植物。紫苏在亚洲南至印度尼西亚，东至日本、朝鲜均有分布[1]。我国广泛栽培，2015年版《中国药典》规定其叶、子、梗均为药用部位。中医学理论认为，紫苏具有解表散寒、宣肺化痰、行气和胃等功效，临床主要用于急性胃炎、肠炎、肾炎、慢性支气管炎等炎性疾病的治疗[2-7]。紫苏叶中的黄酮类、酚酸类、萜类、挥发油类成分为紫苏叶的主要化学成分[8-11]，但其抗炎活性成分的报道较少。本研究中系统分离了紫苏叶的化学成分，以RAW264.7细胞为评价模型，评价了各化合物对诱导型一氧化氮合酶（iNOS）及环氧合酶2（COX-2）蛋白表达水平的影响。现报道如下。

1 仪器、试药与细胞

1.1 仪器

Bruker-400型核磁共振（NMR）仪（四甲基硅烷内标，德国Bruker公司）；Agilent 1100型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司），配有紫外检测器；JY-SCZ2型电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）；4600型全自动化学发光成像分析仪（上海天能科技有限公司）；正向硅胶色谱柱（中国青岛海洋化工厂）；D101大孔吸附树脂（沧州宝恩树脂科技有限公司）；反相ODS硅胶色谱柱（美国Welch公司）。

1.2 试药

二甲基亚砜（DMSO，美国Sigma公司，批号为180412）；Peroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit（批 号 为P181123），Anti-β-actin（批 号 为sc 69879），均 购 自 美 国Proteintech Group Inc.；P-Tau Rabbit mAb（Cell Signaling，批号为15013）；Tau Rabbit mAb（Abcam公司，批号为46687）；MarKer（Rainbow公司，批号为20190302）；细胞裂解液（批号为20190425），PMSF（批号为20190327），电化学发光（ECL）法发光液（批号为20190402），均购自上海碧云天生物技术有限公司；四甲基乙二胺（TEMED，批号为191037），聚偏氟乙烯膜（PVDF膜，批号为192113），均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；甲醇等有机试剂均购自天津大茂化学试剂有限公司；紫苏叶购自辽河大药房，批号为20170335，经哈尔滨商业大学吴健博士鉴定为紫苏Perilla frutescens（L.）Britt.的干燥叶。

1.3 细胞

RAW264.7细胞株（ATCC，批号为20160812）。

2 方法与结果

2.1 提取与分离

取干燥紫苏叶15 kg，以8倍量75%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并提取物，减压浓缩至无醇味，得提取物浸膏2.3 kg。浸膏以蒸馏水溶解，用D101大孔吸附树脂分离，以乙醇-水溶液（0→100%）梯度洗脱，30%洗脱部分经硅胶柱、十八烷基硅烷键合硅胶（ODS）柱进一步分离，采用高效液相色谱（HPLC）法纯化得到化 合 物1（23.5 mg）、化 合 物2（17.6 mg）、化 合 物3（21.2 mg）、化合物4（17.3 mg）；60%洗脱部分经硅胶柱、C18ODS柱进一步分离，采用HPLC法纯化，得到化合物5（13.8 mg）、化合物6（26.1 mg）。

2.2 化合物鉴定

化合物1：淡黄色油状物。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）：6.97（1H，d，J=15.8 Hz，H-7），6.27（1H，d，J=15.8 Hz，H-8），5.86（1H，brs，H-4），2.64（1H，d，J=16.9 Hz，H-2），2.17（1H，m，H-2），2.26（3H，s，H-10），1.80（3H，s，H-11），0.96（3H，s，H-12），0.92（3H，s，H-13）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）：41.2（C-1），49.3（C-2），198.3（C-3），126.6（C-4），161.8（C-5），78.1（C-6），147.2（C-7），130.5（C-8），198.5（C -9），27.2（C-10），18.6（C-11），23.2（C-12），24.2（C-13）。以上波谱数据与文献[12]报道结果基本一致，经鉴定，化合物1为4-hydroxy-4，5-trimethyl-3-（3-oxobut-1-enyl）cyclohex-2-enone（C13H18O3）。

化合物2：淡黄色粉末。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）：5.79（1H，brs，H-8），4.10（1H，m，H-3），2.31（1H，dd，J=13.3，2.5 Hz，H-2），1.88（1H，dd，J=14.1，2.5 Hz，H-4），1.68（3H，s，H-12），1.64（1H，dd，J=13.3，3.6 Hz，H-2），1.43（1H，dd，J=14.1，3.6 Hz，H-4），1.39（3H，s，H-11），1.21（3H，s，H-10）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）：35.9（C-1），46.8（C-2），65.1（C-3），45.5（C-4），86.7（C-5），171.3（C-7），112.5（C-8），183.3（C-9），25.4（C-10），30.6（C-11），27.0（C-12）。以上波谱数据与文献[13]报道结果基本一致，经鉴定，化合物2为loliolide（C11H16O3）。

化合物3：淡黄色油状物。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）：6.89（1H，d，J=16.1 Hz，H-7），6.31（1H，d，J=16.1 Hz，H-8），2.76（1H，dd，J=13.6，2.1 Hz，H-2），2.37（1H，m，H-4），2.28（3H，s，H-10），2.06（1H，m，H-4），1.77（1H，dd，J=13.3，2.1 Hz，H-2），1.66（1H，m，H-5），0.93（3H，s，H-11），0.88（3H，s，H-12），0.81（3H，d，J=6.1 Hz，H-13）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）：42.9（C-1），51.2（C-2），210.2（C-3），44.7（C-4），35.7（C-5），77.1（C-6），150.7（C-7），131.3（C-8），198.0（C-9），27.3（C-10），24.6（C-11），24.6（C-12），16.1（C-13）。以上波谱数据与文献[14]报道结果基本一致，经鉴定，化合物3为（E）-4-hydroxy-3，3，5-trimethy1-4（3-oxobut-1-en-1-yl）cyclohexan-1-one（C13H20O3）。

化合物4：白色粉末。1H-NMR（400 MHz，DMSOd6）：5.78（2H，s，H-8），4.08（1H，m，H-3），2.29（1H，dd，J=13.3，2.5 Hz，H-2），1.87（1H，m，H-4），1.67（3H，s，H-12），1.62（1H，m，H-2），1.44（1H，m，H-4），1.38（3H，s，H-11），1.18（3H，s，H-10）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）：34.7（C-1），47.4（C-2），63.0（C-4），49.7（C-5），86.4（C-8），170.9（C-9），112.3（C-10），181.8（C-11），26.2（C-12）。以上波谱数据与文献[15]报道结果基本一致，经鉴定，化合物4为isololiolide（C11H16O3）。

化合物5：淡黄色油状物。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）：7.00（1H，d，J=1.4 Hz，H-2），6.87（1H，d，J=8.2 Hz，H-5），6.82（1H，s，H-2′），6.72（1H，d，J=8.0 Hz，H-5′），6.69（1H，d，J=8.0 Hz，H-6′），6.64（1H，d，J=8.2，1.4Hz，H-6），5.30（1H，d，J=4.6 Hz，H-7），4.72（1H，m，H-8），4.58（1H，m，H-9′），4.48（1H，m，H-9′），4.23（2H，m，H-9），3.74（3H，s，3-OCH3），3.71（3H，s，3′-OCH3），2.62（2H，m，H-7′），1.69（2H，m，H-8′）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）：133.5（C-1），111.6（C-2），147.2（C-3），145.6（C-4），114.8（C-5），119.7（C-6），71.8（C-7），84.2（C-8），60.3（C-9），133.5（C-1′），113.1（C-2′），149.8（C-3′），146.2（C-4′），116.3（C-5′），120.3（C-6′），31.4（C-7′），34.7（C-8′），60.5（C-9′），55.6（3-OCH3），55.8（3′-OCH3）。以上波谱数据与文献[16]报道结果基本一致，经鉴定，化 合 物5为erythro-（7 S，8 R）-guaiacyl-glycerolβ-O-4′-dihydroconiferyl ether（C20H26O7）。

化合物6：黄色油状物。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）：7.09（1H，d，J=8.4，1.7 Hz，H-6′），7.04（1H，d，J=8.4 Hz，H-5′），6.93（1H，d，J=8.2，1.7 Hz，H-6），6.90（1H，d，J=1.7 Hz，H-2），6.79（1H，d，J=1.7 Hz，H-2′），6.67（1H，d，J=8.2 Hz，H-5），4.91（1H，d，J=7.0 Hz，H-1′′），4.80（1H，d，J=5.2 Hz，H-7），4.29（1H，m，H-8），3.76（3H，s，3-OCH3），3.73（3H，s，3′-OCH3），3.65（1H，m，H-6′′），3.57（1H，dd，J=11.8，2.8 Hz，H-9），3.49（1H，dd，J=11.8，3.5 Hz，H-9），3.44（1H，m，H-6′′），3.43（2H，t，J=6.4 Hz，H-9′），3.29（1H，m，H-3′′），3.24（1H，m，H-5′′），3.22（1H，m，H-4′′），3.12（1H，m，H-2′′），2.57（2H，m，H-7′），1.71（2H，m，H-8′）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）：136.3（C-1），111.9（C-2），148.5（C-3），145.7（C-4），114.7（C-5），116.2（C-6），71.6（C-7），84.0（C-8），60.1（C-9），136.4（C-1′），113.1（C-2′），149.8（C-3′），146.1（C-4′），114.8（C-5′），3′-OCH3，120.3（C-6′），31.5（C-7′），34.7（C-8′），60.4（C-9′），55.7（3-OCH3），55.8（3′-OCH3），100.3（C-1′′），73.5（C-2′′），77.2（C-3′′），69.9（C-4′′），77.1（C-5′′），60.8（C-6′′）。以上波谱数据与文献[17]报道结果基本一致，经鉴定，化合物6为erythro-（7S，8R）-guaiacyl-glycerol-β-O-4′-dihydroconiferyl ether-7-O-β-D- glucopyranoside（C26H36O12）。

2.3 抗炎活性评价

将RAW264.7细胞株培养于DMEM培养基中[含有10%胎牛血清（FBS）]，细胞按每孔8×104个/0.5 mL接种至24孔板内孵育24 h。使用不同待测化合物（DMSO溶解，终浓度为80μmol/L）及阳性药地塞米松预处理1 h，用脂多糖（质量浓度为100 ng/mL）刺激18 h，提取细胞总蛋白，采用蛋白免疫印迹（Wester blotting）法检测iNOS和COX-2蛋白的表达水平。

经质量浓度为100 ng/mL的脂多糖刺激后，iNOS和COX-2蛋白的表达水平均显著升高，提示细胞炎性模型造模成功。由图1可见，阳性药地塞米松可显著抑制iNOS和COX-2蛋白的表达。化合物1可显著抑制COX-2蛋白的表达，化合物2，3，4均可显著抑制iNOS蛋白的表达，提示其均有抗炎活性。

图1 化合物1-6对RAW264.7细胞中iNOS及COX-2蛋白表达的抑制Fig.1 Inhibitory effect of compounds 1-6 on the expression of iNOS and COX-2 protein in RAW264.7 cells

3 讨论

紫苏叶的75%乙醇-水提取物经大孔吸附树脂洗脱，正向硅胶柱、反相C18ODS柱及葡聚糖凝胶色谱柱等常规柱色谱方法进行分离，采用半制备型HPLC法对所得成分进行纯化，最终得到6个单体化合物，应用NMR技术，并参照文献，最终明确了这6个单体成分的结 构。分 别 为4-hydroxy-4，5-trimethyl-3-（3-oxobut-1-enyl）cyclohex-2-enone（化 合 物1），loliolide（化合物2），（E）-4-hydroxy-3，3，5-trimethy-1-4（3-oxobut-1-en-1-yl）cyclohexan-1-one（化合物3），isololiolide（化合物4），erythro-（7S，8 R）-guaiacyl-glycerol-β-O-4′- dihydroconiferyl ether（化 合 物5），erythro-（7 S，8 R）-guaiacyl-glycerolβ-O-4′-dihydroconiferyl ether-7-O-β-D-glucopyranoside（化合物6）。

以RAW264.7细胞为评价模型，对分离得到的各单体成分的体外抗炎活性进行初步评价。通过Western blotting法检测化合物对相关蛋白表达水平的影响，确定化合物的抗炎活性。结果显示，化合物2，3，4在80μmol/L时可显著抑制iNOS蛋白的表达，化合物1可抑制COX-2蛋白的表达。本研究明确了紫苏叶的抗炎活性成分，为后续紫苏叶的开发和应用奠定了基础。