赵 莹，翟 明，李苑华，张声源，江中洪

（1.嘉应学院，广东 梅州 514031； 2.广东省山区特色农业资源保护与精准利用重点实验室，广东 梅州514031； 3.嘉应学院医学院附属医院，广东 梅州 514031）

中医学认为，手足癣由外感湿热、毒虫沾染引起，日久郁阻皮肤脉络，造成血不荣肤，治疗多选用杀虫、祛湿、清热、祛风、活血之剂[1]。本课题组的前期研究中结合中医学理论基础，选用具有杀虫、祛湿、清热、祛风、活血等功效的皂角、荆芥、红花及白矾4味中药组方[2-4]，筛选其对具有抗真菌和抗炎作用的有效成分[5-6]，以槲皮素和总黄酮为指标成分，优化提取方法。目前，市场上的抗足癣软膏多为化学抗菌药物[7-8]，抗足癣类中药仍以洗剂为主[9-10]，而洗剂不易携带，药液难以附着于皮肤，起效较慢。本研究中在对提取工艺进行优化后，拟开发一种复方中药抗足癣软膏，通过正交设计优化其制备工艺，并考察制剂的稳定性，为复方中药止癣乳膏的开发及工业化生产提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UV-1800型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；MING-CHE 24UV型超纯水机（法国Merck Millipore公司）；TDZ5-WS型台式离心机（长沙湘锐离心机有限公司）；DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱（上海鸿都电子科技有限公司）；BSA1245型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司，精度为万分之一）；JP-060型超声波清洗机（深圳市洁盟设备有限公司，功率为240W，频率为40kHz）。

1.2 试药

槲皮素对照品（北京北纳创联生物技术研究所，批号为C15H1007，纯度≥98%）；芦丁对照品（奥科生物科技研究所，批号为BWB51607，纯度≥98%）；其他试剂均为分析纯；皂角药材（批号为20180115），荆芥药材（批号为20180926），均购于宿迁圣轩阁有限公司；红花药材（批号为20180709），白矾药材（批号为20170813），均购于大参林药业股份有限公司。上述中药材均经嘉应学院医学院张声源中药学副教授鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 提取工艺研究

2.1.1 复方中药处方

取皂角、荆芥、红花、白矾药材各3 g，按1∶15（m/V）料液比进行配制。

2.1.2 提取方法考察[11-12]

水提法：1）水煎煮法。按1∶15（m/V）料液比加水，提取2次，合并提取液，滤纸过滤，密封备用。2）水超声法。按1∶15（m/V）料液比加水，超声提取（功率为240 W，温度为50℃）1.5 h，提取液用滤纸过滤，密封，备用。

酸提法：1）酸浸提法。冰乙酸浸渍提取24 h，提取液用滤纸过滤，密封，备用。2）酸超声法。提取条件与水超声法相同，提取溶剂换为冰乙酸。

醇提法：醇浸提法与醇超声法的反应条件分别同酸浸提法和酸超声法一致，提取溶剂更换为70%乙醇。

2.1.3 总黄酮提取率考察

芦丁对照品溶液制备：称取芦丁对照品9.4 mg，精密称定，置100 mL烧杯中，以60%乙醇溶液溶解，吸取0.5 mL，置50 mL容量瓶中，定容至刻度，即得质量浓度为0.188 mg/mL的对照品溶液，备用。

芦丁线性关系考察：分别精密吸取芦丁对照品溶液0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL，置10 mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min；加10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min；加4%NaOH溶液4 mL，再用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置15 min，显色[13]，于510 nm波长处测定吸光度。得回归方程Y=0.220 8 X+0.006 8，R2=0.999 5（n=6），表明芦丁质量浓度在0.5～5.0 mg/mL范围内与吸光度线性关系良好。

总黄酮提取率测定：按2.1.2项下提取工艺进行提取，过滤，取提取液1 mL，置50 mL容量瓶中，稀释至刻度，即得供试品溶液。精密吸取供试品提取液1 mL，置100 mL容量瓶中，按标准曲线项下方法测定吸光度[13]。按公式1）计算总黄酮提取率（X）。结果见图1。

图1 不同提取方法的总黄酮提取率比较Fig.1 Comparison of extraction rates of total flavonoid by different extraction methods

式中，X为总黄酮或槲皮素的提取率（%）；C为根据标准曲线计算的总黄酮或槲皮素质量浓度（mg/mL）；V为药材提取液总体积（mL）；P为稀释倍数；W为药材质量（mg）。

由图1可知，超声醇提法的总黄酮提取率最高为60.16%。水提取和醇提取过程中，超声法的提取率高于煎煮法或浸渍法；酸提取过程中，浸提法高于超声法。

2.1.4 槲皮素提取率考察

槲皮素对照品溶液制备：取槲皮素对照品1.5 mg，精密称定，于烧杯中溶解，润洗2～3次，用少量蒸馏水溶解后转移至100 mL容量瓶中，即得质量浓度为15μg/mL的对照品溶液，备用。

槲皮素线性关系考察：分别精密吸取槲皮素对照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL，置25 mL容量瓶中，以蒸馏水为空白参比，于382 nm波长处测定吸 光 度。得 回 归 方 程Y=0.341 9X-0.002 1，R2=0.9992（n=8），表明槲皮素质量浓度在0.1～0.6 mg/mL范围内与吸光度线性关系良好。

槲皮素提取率测定：按2.1.2项下提取工艺进行提取，过滤，取提取液1 mL，置50 mL容量瓶中，稀释至刻度，即得供试品溶液。精密吸取总黄酮提取率测定项下供试品提取液1 mL，置50 mL容量瓶中，按公式1）计算槲皮素提取率（X）。结果见图2。

图2 不同提取方法的槲皮素提取率比较Fig.2 Comparison of extraction rates of quercetin by different extraction methods

由图2可知，以水和醇作为提取溶剂时槲皮素的提取率高于以酸为提取溶剂，且超声法高于煎煮法或浸提法。分析原因，相较于浸提法及煎煮法，超声法的温度和超声微波作用可提高提取率，从而增加槲皮素在提取溶剂中的溶解度，则槲皮素的浸出量相对较多。结合总黄酮提取率，则槲皮素的提取率为0.07%。

2.1.5 最佳提取工艺确定

综合总黄酮和槲皮素的提取率考察结果，最终确定该复方最佳提取工艺为70%乙醇超声提取，功率为240 W，温度为50℃，提取1.5 h。

2.2 槲皮素与总黄酮含量测定方法学考察

精密度试验：精密吸取槲皮素、总黄酮对照品溶液各0.2 mL，按标准曲线项下方法测定吸光度，重复测定6次。结果槲皮素、总黄酮吸光度的RSD分别为0.21%和1.28%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取复方中药材粉末，各3 g，精密称定，按上述最佳提取工艺提取，共制备供试品溶液12份，按标准曲线项下方法测定吸光度。结果槲皮素、总黄酮吸光度的RSD分别为0.26%和1.75%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取复方中药材粉末，各3 g，精密称定，按上述最佳提取工艺提取，过滤提取液，精密吸取提取液0.2 mL，于室温下放置0，1，3，5，7，9，12，24 h时按标准曲线项下方法测定吸光度。结果槲皮素、总黄酮吸光度的RSD分别为0.33%和1.52%（n=8），表明供试品溶液在室温下放置24 h稳定性良好。

2.3 制备工艺研究

2.3.1 处方及制备

乳膏处方见表1。制备步骤为，按处方量称取A，C两相中各原料作为水相，称取处方量B相中各原料作为油相，置（80±2）℃恒温水浴箱中，搅拌，混匀，待油、水两相完全溶解后，用温度计测量温度至（80±2）℃后，把油相（B相）倒入水相（A，C相）中，用玻璃棒在水浴锅中往同一方向缓慢搅拌15 min，移出，室温下继续搅拌至冷凝。

表1 复方中药乳膏基质组分Tab.1 Matrix components of TCM compound cream

2.3.2 乳膏评分标准

总分100分，其中外观质量、pH、离心稳定性及耐热、耐寒稳定性各20分。具体评分标准见表2。

表2 乳膏评分标准Tab.2 Scoring criteria of cream

2.3.3 制备工艺优选

以十二烷基硫酸钠（因素A）和单硬脂酸甘油酯（因素B）的含量、乳化温度（因素C）、乳化时间（因素D）为考察因素，设计正交试验因素水平表（见表3）。以综合评分为评价指标，采用L9（34）正交试验设计制备工艺（见表4），并采用SPSS22.0统计学软件分析。正交试验方差分析结果见表5。

表3 正交试验因素水平表Tab.3 The factor levels of the orthogonal test

由表4可知，各因素对结果影响大小的顺序为D＞C＞A＞B，且最优处方为A3B2C2D1，即十二烷基硫酸钠含量为1.5%，单硬脂酸甘油酯含量为4.0%，乳化温度为80℃，乳化时间为15 min。由表5可知，各因素对结果均有显著影响。故最终确定此条件为最优制备工艺。

表4 L 9（34）正交试验设计方案及结果Tab.4 Design scheme and results of the L 9（34）orthogonal test

表5 L 9（34）正交试验方差分析结果Tab.5 ANOVA results of the L 9（34）orthogonal test

3 讨论

本研究中选取皂角中具有抑菌作用的主要成分槲皮素，以及4味中药中均含有的抗炎成分总黄酮[14-17]的提取率作为考察指标，建立其紫外分光光度测定方法，筛选提取条件。

分别选择了煎煮、浸渍、超声、加热回流4种提取方法[18]，经过含量测定发现，加热回流提取法的提取液中槲皮素和总黄酮的响应值均较低，原因可能为加热回流提取过程中药材的结构被破坏，有效成分含量降低，故最终选择煎煮、浸渍和超声3种提取方法进行研究。由图1和图2可知，超声水提法和超声醇提法的总黄酮和槲皮素提取率均较高，其中超声醇提法总黄酮提取率最高，可能是由于超声的空化作用、机械效应和热效应等加速复方中药材胞内有效物质释放、扩散和溶解，提高了复方中药的提取率。样品中总黄酮含量远高于槲皮素含量，故最终确定最优提取工艺为超声醇提法。

温度对油、水两相的融合、乳化有重要影响。温度过低导致乳化不完全；温度过高导致水分散失，使乳膏基质失水变稠。乳膏制备工艺的单因素考察结果显示，70℃和90℃温度下乳膏的基质得分较低。70℃时离心试验和耐热试验均出现油水分离现象，原因可能为温度较低时油、水两相乳化不充分；90℃时，水分挥发过快，乳膏基质变稠、质地变硬、有颗粒感。故选择75，80，85℃进行正交试验。且乳化时间过短会导致油、水两相乳化不完全，造成基质稳定性差，耐热、离心试验均会出现油、水分离现象。故选择15，20，25 min乳化时间进行正交试验。

制备工艺优化中发现，以十二烷基硫酸钠为乳化剂，制得的水包油（O/W）型乳膏易于涂抹、清洗，使用方便。基质筛选时发现，在该处方中，不需将白凡士林与羊毛脂合用，单用白凡士林已有较好的吸水性，且制得的乳膏颜色洁白，耐寒、耐热，pH稳定在6.9～7.0，质地、均匀度、涂展性均良好，皮肤润滑度适中，不油腻，易清洗，久置不易变质。药物的加入方式考察中，对比了主药提取液的2种不同加入方法。一是将主药提取液与水相混合，提取液作为水相中的一部分，水浴加热后与油相在相同温度下混合；二是先将水相与油相在水浴中混合均匀，再加入主药提取液。2种方法所制得乳膏的外观、稳定性及载药量差异均不大，表明药物的加入方式不是制备中药复方止癣乳膏的主要影响因素。