吴 坚，张锡洪，徐文坚

（1.广东省汕头市中心医院，广东 汕头 515031； 2.广东省中山市小榄人民医院，广东 中山 528400）

发热、乏力、干咳等症状是新型冠状病毒肺炎（COVID-19）感染初期的临床表现，重症患者可出现呼吸困难与低氧血症，甚至发展为急性呼吸窘迫综合征等[1]。目前尚无特效药物及疫苗，临床针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）感染患者的治疗，多数沿用既往冠状病毒感染的临床治疗经验[2]。炎性风暴由于机体的免疫系统应答过于强烈，大量释放细胞因子对肺组织造成损伤，是致使患者病情恶化甚至死亡的重要原因[3]。COVID-19患者由于后期机体产生炎性风暴导致多器官衰竭而死亡。参考文献[4]分析了COVID-19患者的特征，发现患者特别是重症患者的淋巴细胞计数均显著降低，炎性因子白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）等水平均显著升高。IL-6是与炎性反应关系最密切的炎性因子，常在急慢性炎性部位产生，通过与IL-6受体（IL-6R）结合诱导转录炎性应答，刺激更多细胞因子产生，参与炎性风暴[5]。IL-6/IL-6R的结合效应引发蛋白酪氨酸激酶（JAK）、信号传导与转录激活因子（STAT3）、白细胞介素17A（IL-17A）、磷脂酰肌醇3-激酶-苏氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）、转录因子-κB（NF-κB）、Toll样受体（TLR）等下游信号级联反应[6-7]，其信号通路的激活会刺激IL-6靶向应答基因的表达，在信息传导、细胞增殖、分化、免疫调节、炎症、血管生成、肿瘤的发生和转移中起重要作用。此外，低氧诱导因子1α（HIF-1α）信号通路靶向调控B细胞分泌IL-6，影响T细胞分化[8]。该过程参与免疫调控，和机体的炎症密切相关。IL-6可诱导免疫细胞分泌血管内皮生长因子（VEGF），VEGF可提高血管的通透性，促使炎性细胞渗出[9]。血管形成和炎性反应是2个相互依赖的过程。上述因子间相互调节，形成一个复杂的网络，促进组织炎症的发生和发展。目前，我国发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第八版）》[10]已明确将IL-6水平上升作为病情恶化的临床警示指标，采用糖皮质激素作为免疫抑制剂治疗炎性风暴，用于遏制重症患者的免疫激化反应，但糖皮质激素的使用可能会降低机体抗病毒的能力，造成二次感染、病程延长及骨质疏松、股骨头坏死等不良预后，且存在严重后遗症风险，严重影响患者的生活质量[11]。

我国中医药在治疗SARS-CoV-2感染、COVID-19患者中发挥了重大作用。中药“多成分-多靶点-多效应”的整体治疗特点使其在疾病防治方面具备独特的优势和潜力。中药成分复杂，中药单体作为中药发挥疗效的物质基础，挖掘和筛选中药单体具有重要意义。目前尚缺乏抗COVID-19炎性风暴相关机制研究的文献报道，且尚未系统阐明中药各组分及其治病机理。随着各种高通量多组学技术的迅速发展，网络药理学及分子对接技术为探索中药的科学依据提供了新策略[12]。网络药理学在系统药理学和生物信息学及计算机技术的基础上通过计算、分析与预测的研究方式将中药及其成分和疾病生物网络联系起来，以期挖掘和发现药效物质及其潜在的治病机制[13]。分子对接技术通过化学计量学方法模拟受体和配体间的相互作用，准确预测两者结合的可能性，还可根据两者的结合情况优化受体和配体的结构，为药物筛选及设计提供新思路[14]。本研究中针对临床报道的与炎性风暴最密切的IL-6R，利用分子对接技术对中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）中的天然小分子进行高通量挖掘，虚拟筛选出IL-6R的天然小分子抑制剂，并通过网络药理学预测富集IL-6R天然小分子抑制剂最多的核心中药干预COVID-19的作用机制，为新药开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 小分子数据库的建立

基于TCMSP数据库，纳入2015年版《中国药典（一部）》收录的499种中药及其含有IL-6R天然小分子抑制剂的化合物共13 143个，下载化合物的MOL2格式3D结构的文件，建立分子对接技术虚拟筛选的小分子数据库。

1.2 基于ADME和Lipinski规则的评估

基于ADME参数[15]即口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18，以及Lipinski规则[16]即相对分子质量（MW）＜500、脂水分配系数（clogP）＜5、氢键给体数目（Hdon）＜5，对小分子抑制剂数据库的活性成分进行初步筛选，筛选药动学性质和OB良好的化合物，以减少阴性结果出现的概率，从结构和性质角度过滤成药性较低的化合物，以提高筛选效率。

1.3 分子对接

在RCSB PDB（http://www.rcsb.org/）网站中下载IL-6R（1N26）的3D结构文件，通过Raccoon软件对小分子进行加氢、加电荷、移除非极性氢、删除孤对电子，以及建立特殊可旋转键等批量预处理。采用Discovery studio 2.5软件将1N26中的配体/底物清除，并获得IL-6R。据报道，Phe229 and Phe279两个氨基酸残基不仅是IL-6R的关键结合位点[17-19]，也是目前IL-6R的研究热点。因此，以Phe229和Phe279两个氨基酸残基在IL-6R中的位置设置用于本研究中分子对接的结合口袋。运用Autodock Vina和Python脚本完成高通量分子对接，根据每个化合物的最优结合能进行排序，若结合能小于0，则说明配体和受体可自发结合，目前分子对接结果的筛选尚无统一标准，以结合能≤-20.92 kJ/mol作为对接依据[19]，为提高结果的可靠性，以结合能≤-25.10kJ/mol作为筛选潜在活性成分的对接依据。

1.4 成分靶点预测及其抗COVID-19靶点确认

将核心中药的潜在活性成分导入TCMSP数据库中，获得成分对应的靶点，将潜在靶点进一步映射到Uniprot（http://www.uniprot.org/）数据库，并转换为官方名称（gene symbol）。检索OMIM和GeneCard数据库有关COVID-19的相关靶点，将成分靶点和疾病靶点输入Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在线服务器中，获得两者的交集部分，即为核心中药干预COVID-19发生、发展的潜在靶点，并将这些靶点导入String数据库中获得蛋白质相互作用（PPI）网络。

1.5 GO基因功能注释和KEGG通路富集分析

将预测核心中药对有效成分的潜在靶点提交到生物信息学数据库DAVID 6.8进行GO基因功能注释和KEGG通路富集分析，以预测核心中药的分子机制。

1.6 成分-靶点-通路网络构建

将核心中药的活性成分、潜在靶点及相关通路信息导入Cytoscape 3.7.1软件，以构建成分-靶点-通路网络，阐释其多效协同的作用特点。

2 结果

2.1 基于ADME和Lipinski规则的评估

13 143个化合物中，2 454个成分满足要求，即OB≥30%且DL≥0.18。在符合ADME性质的基础上，1 511个成分同时符合ADME和Lipinski规则的要求，共涉及372个中药，提示上述成分具有良好的药动学性质、OB及OL。

2.2 分子对接

2.2.1 与IL-6R对接结合能在不同区间的分析

初筛结果显示，分子对接数据显示结合能在（-25.10，0]kJ/mol区间的成分有624个，在（-29.29，-25.10]kJ/mol区间的成分有800个，在（-33.47，-29.29]kJ/mol区间的成分有86个，结合能小于-33.47 kJ/mol的成分仅1个，提示存在87个成分具有较强且稳定的结合结果，说明上述成分具有良好的开发潜能。其中，芝麻素（sesamin）与IL-6R的结合最好，提示该化合物具有良好的开发潜能，由于数据较多，因此本研究仅展示结合能小于-29.29 kJ/mol的结果。详见表1。

2.2.2 成分和中药分布情况

由表1可知，结合能小于-25.10 kJ/mol的成分共887个，通过TCMSP进行成分的中药归属分析见图1。6味清热药板蓝根、白屈菜、苦地丁、苦参、赤芍、关黄柏，4味活血化瘀药丹参、延胡索、没药、桃仁，3味止咳平喘药百部、桑白皮、洋金花，3味补益药甘草、枸杞子、灵芝，2味理气温理药枳实、吴茱萸，化瘀止血药降香，1味祛风湿散寒药雷公藤。其中，甘草含有IL-6R天然小分子抑制剂成分最多，主要包括多糖类、黄酮类、三萜类等，提示甘草在干预COVID-19中发挥着重要作用。

图1 活性成分整体富集15个及以上的中药Fig.1 Traditional Chinese medicine with overall enrichment of 15 or more active components

结合能小于-25.10 kJ/mol的成分中，能富集10种中药以上的成分有16个（见表2）。其中，木犀草素富集的中药种类最多，为90种。说明木犀草素来源广泛，且其与IL-6R也有较好的结合。16个化合物中，多数为黄酮类化合物，说明黄酮类化合物在天然药物中广泛存在，提示该类成分在抑制IL-6R活性上具有良好的开发潜能。

表2 整体成分富集10种中药以上的成分Tab.2 Components with more than 10 traditional Chinese medicines enriched in overall components

由表1可知，与IL-6R的结合能小于-29.29kJ/mol的87个成分中，能富集4种中药以上的成分有9个（见图2）。其中，富集药材数量排名前3的成分分别为MOL001458-黄连碱（9味中药）、MOL001558-芝麻脂素（7味中药）、MOL007180-维生素E（8味中药），其中芝麻脂素与IL-6R的结合最强，来源广泛。

图2 筛选关键成分（能富集4种以上的中药）的网络Fig.2 Network for screening key components（capable of enriching more than four kinds of traditional Chinese medicines）

表1 与IL-6R对接结合能小于-29.29 k J/mol的成分Tab.1 Components with docking binding energy less than-29.29 k J/mol with IL-6R

包含4个及以上活性成分的中药有7味（见图3），包含成分数量排名前3的中药分别为甘草（10个成分）、苦地丁（8个成分）、白屈菜（6个成分）。可见，甘草不仅是与IL-6R结合能小于-25.10kJ/mol化合物最多的中药，还是与IL-6R结合能小于-29.29 kJ/mol化合物最多的中药，提示甘草在抑制IL-6R中具有良好的潜在活性。

图3 筛选核心中药（包含活性成分不少于4个）的网络Fig.3 Network for screening core traditional Chinese medicine（including no less than four active components）

2.3 甘草干预COVID-19的网络药理学机制分析

潜在靶点：甘草为治疗COVID-19的核心中药，共获得82个甘草对应的靶点，259个COVID-19相关靶点，将两者的靶点进行比对，获得16个甘草干预COVID-19的潜在靶点。结果见图4。

图4 甘草治疗COVID-19的潜在靶点Fig.4 Potential targets of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma against of COVID-19

KEGG通路富集分析：甘草干预COVID-19的通路可视化结果见图5。图中显示了排名前20的信号通路，16个潜在靶点参与的信号通路主要与免疫与炎症、癌症、慢性疾病等密切相关，包括HIF-1 signalingpathway、VEGFsignaling pathway、血小板活化（Platelet activation）、Pathways in cancer、TNF signaling pathway等79条，P＜0.01的通路有63条。其中，HIF-1，VEGF，Platelet activation，TNF，PI3K-Akt，IL-17，TLR信 号 通 路 与COVID-19的发生、发展密切相关，提示甘草可能通过上述通路发挥抗COVID-19的作用。甘草干预COVID-19的GO生物功能注释结果见图6。结果显示，16个靶点主要注释了7个方面的生物功能，包括胸腺发育（thymus development）、花生四烯酸代谢过程（arachidonic acid metabolic process）、肌肉收缩的负调节（negative regulation of muscle contraction）、超氧化物代谢过程（superoxide metabolic process）、脂多糖类介导的信号通路（lipopolysacchiaride-mediated signalingpathway）、血管内皮细胞迁移的调节（regulation of blood vessel endothelial cell migration）、细胞氧化剂排毒（cellular oxidant detoxification），上述功能主要与免疫调节、炎性干预、氧化应激、抗凝与凝血系统调控等生物过程的发生、发展密切相关。

图5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

图6 GO生物功能注释Fig.6 GO biological function annotation

潜在“成分-靶点-通路”网络构建：为了阐释甘草干预COVID-19生物网络的复杂分子机制，本研究筛选通路中P值排名前20的通路，构建“成分-靶点-通路”网络。结果见图7。该网络中共含有98个节点，其中有62个成分（红色）、16个靶点（黄色）、20条通路（绿色），上述节点共构成了578条关系，其中靶点与成分之间存在400条关系，靶点与靶点之间存在65条关系，靶点与通路之间存在113条关系，提示甘草的作用靶点不仅在一定程度上相互影响，还分布于不同的通路上，充分体现了中药治疗疾病是“多成分-多靶点-多途径”相互协调的共同结果。

图7 甘草抗COVID-19的潜在“成分-靶点-通路”网络Fig.7 Potential″component-target-pathway″network of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma against COVID-19

3 讨论

COVID-19属中医“湿毒疫”范畴，主要表现为发热、干咳、乏力、咽痛等。感染病毒后，机体在对抗病毒过程中产生大量氧自由基和炎性因子，破坏支气管及肺泡中的上皮-内皮屏障，造成肺泡-毛细血管氧传递功能障碍和氧扩散能力受损，致使重症COVID-19患者出现呼吸困难与低氧血症，甚至产生严重的凝血功能障碍及形成血栓，易导致患者并发脓毒血症及发展为急性呼吸窘迫综合征，直至后期机体产生炎性风暴导致多器官衰竭乃至死亡。面对COVID-19发生与发展的复杂多变性，在中医辨证施治的理论指导下，中药的整体疗效具有得天独厚的优势。为促进天然分子的高效开发与利用，探讨中药抗COVID-19的药效物质基础及其作用机制意义重大。故本研究中在多项研究的基础上，运用分子对接技术高通量的虚拟筛选，获得了符合ADMELipinski规则且与IL-6R结合较好的IL-6R天然小分子抑制剂887个，其中结合最强的是芝麻素。本研究中筛选获得的IL-6R天然小分子抑制剂多数为黄酮类成分，其中来源最广的为木犀草素；多数IL-6R天然小分子抑制剂集中在清热类药材中，其中含有最多潜在IL-6R天然小分子抑制剂的为甘草，可为IL-6R天然小分子抑制剂的开发提供候选化合物和理论依据。

芝麻素[20]和木犀草素[21]具有显著的抗炎药效，其主要作用机制是通过显著降低环氧合酶2（COX-2）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）等活性，诱导产生炎性介质的限速酶的表达及IL-6，TNF-α等促炎因子的产生。芝麻素[22]和木犀草素[23]还有平衡氧化应激稳态的作用，其主要通过抑制活性氧（ROS）的产生和提高过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性，保护细胞免受氧化应激的损伤。此外，芝麻素[24]和木犀草素[25]还有显著的抗高血压、高血脂、高血糖（简称三高）作用及血管内皮保护功能，表明芝麻素和木犀草素具有潜在的保护心血管系统功能。近期研究表明，冠状动脉粥样硬化性心脏病、高血压、糖尿病患者是COVID-19的易感人群[26]，且三高疾病会加重COVID-19患者的病情。因此，面对并发心血管疾病的COVID-19患者，对其进行抗病毒、抗炎、增强免疫治疗的同时，还应加强防范诱发或加重COVID-19患者病情的危险因素。

此外，本研究中从网络药理学的角度进一步探讨了甘草抗COVID-19可能参与的生物过程与信号通路。KEGG通路富集和GO生物功能注释分析结果表明，甘草参与治疗COVID-19的16个潜在作用靶点主要富集在HIF-1，VEGF，Platelet activation，TNF，PI3K-Akt，IL-17，TLR等与肺癌、肺纤维化、肺炎、气道炎症、肺栓塞等肺部疾病密切相关的信号通路中，上述通路主要涉及免疫调节、炎性干预、氧化应激、抗凝与凝血系统调控等生物功能，提示甘草通过多通路协同发挥治疗COVID-19的作用。

甘草具有润肺止咳、补气益肾、调和解毒、缓急止痛等功效，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、调节免疫等多种药理学作用，国内外一直用甘草及其提取物治疗咳嗽、支气管炎、肺炎等呼吸系统疾病，主要通过抑制氧化应激和细胞凋亡，改善免疫功能而抑制炎性细胞因子表达、减轻肺纤维化形成和急性肺损伤等，以保护肺上皮细胞，改善肺功能，保护宿主；其物质基础主要包括多糖类、黄酮类、三萜类等，尤其是甘草酸苷、甘草素、异甘草素、甘草酸二铵及甘草酸、甘草查尔酮A、光甘草定等成分[27]。有研究证实，甘草酸作为甘草中含量最高的有效成分，其化学结构与激素类似，具有类皮质激素作用，主要用于对抗病毒炎性风暴，两者同为抗炎药，最大的区别在于甘草酸无免疫抑制作用[28]。因此，甘草酸在抗炎的安全剂量范围内既可抵抗炎性风暴，又不干扰机体对抗病毒的能力。复方甘草酸苷用于治疗非典型肺炎的临床效果确切，其主要成分甘草酸苷为甘草中的有效活性成分[29]，具有保护肝细胞膜、抗炎、抗病毒、调节免疫等药理学作用，鉴于SARS-CoV-2与SARS-CoV有很多相似之处[30]，因此，考虑甘草酸苷用于治疗SARS-CoV-2具有很大的借鉴意义。作为甘草主要活性成分之一的甘草酸二胺能明显抑制普通型COVID-19患者的炎性反应，提高免疫功能[31]，且临床疗效显著，安全性高。

甘草次酸具有抑制血小板聚集的作用，可能是通过抑制血小板活化因子生物合成的通路，除了通过抑制COX-2蛋白和mRNA表达外，还能抑制磷脂酶A2活性、血栓素A2合成、磷酸二酯酶升高，降低环磷酸腺苷水平等多个环节，实现抑制血小板聚集作用，阻断血栓形成，进而防治肺栓塞的发生、发展[32]。异甘草素和甘草酸作为甘草的主要活性成分[33]，是一种凝血酶抑制剂，能延长血浆复钙、凝血酶和纤维蛋白原凝块时间，抑制凝血酶诱导血小板聚集，抑制血栓形成，上述过程主要受VEGF信号通路和Platelet activation通路调控。甘草及其有效成分具有降糖、调脂作用，可从源头上防治糖尿病及其并发症的发生和发展[34]。糖尿病并发症信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）为调控糖尿病、糖尿病并发症的重要信号通路[35]，甘草酸及其苷元甘草次酸可通过AGE-RAGE信号通路防治糖尿病肾病和糖尿病血管病变[36]。甘草单一成分的多靶点药效和机制研究提示上述成分对甘草抗COVID-19药效具有重要贡献。

甘草有效成分对心、脑、血管、肝、肾、肺等各种脏器具有保护作用[37]，有助于防治糖尿病引起的各种并发症，提示甘草有利于阻断COVID-19炎性风暴对患者多器官的损伤。因此，甘草可在减轻炎症对机体急性损伤的同时，面对危重患者的高凝状态还有防治肺栓塞的潜在药效，提示甘草不仅具有潜在的抗COVID-19炎性风暴作用，还能有效防治并发症的发生、发展，这可能与甘草配伍其他中药治疗COVID-19患者起到协同增效、调和诸药作用有关。目前，未见甘草及其主要活性成分抗COVID-19的潜在机制HIF-1，PI3K-Akt信号通路的相关报道，但可为甘草及其主要活性成分抗COVID-19的作用机制研究提供新的研究方向和思路，以及为抗COVID-19的新药开发提供候选化合物及甘草抗COVID-19的物质基础和作用机制的阐释提供一定理论依据。

我国自主研发的“三方三药”[38]在此次抗疫中起到了非常重要的作用，“三方三药”中的“清肺排毒汤”“化湿败毒方”“宣肺败毒方”，以及连花清瘟颗粒/胶囊、血必净注射液、金花清感颗粒6个中药组方均含有甘草。从清肺排毒汤中共鉴定出了39种化学成分[39]，且检测到其入血成分共12种，这些成分广泛分布于血清、心、肝、脾、肺、肾中，包括甘草的甘草酸、甘草苷等主要成分；连花清瘟中鉴定出61种化学成分，且22种以原型入血，包括甘草的主要成分芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、异甘草苷、甘草苷、甘草素、甘草酸等[40]。对全国抗COVID-19方剂的组方规律的分析结果表明，甘草的使用频次最高[41]。本研究结果与以上研究不谋而合，可为抗COVID-19方剂配伍甘草的原因提供更多参考。

本研究中以分子对接技术高通量虚拟筛选获得了最具代表性的潜在抗IL-6R的天然小分子抑制剂如芝麻素和木犀草素等化合物，以及包含该类天然小分子抑制剂最多的中药甘草。芝麻素和木犀草素除了具有抗IL-6R的潜在活性外，还具有抗炎、抗氧化、降血压、调脂、降血糖等多种药理作用，具备应对COVID-19复杂发生、发展的潜在能力。作为“国老”的甘草，不仅其多种化学成分具有潜在的抗IL-6R活性，其多种主要活性成分还具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、抗血栓、调脂、降血糖、增强免疫力等广泛的药理学作用，且对多种器官具有保护作用。甘草通过多种途径抵抗COVID-19对患者器官损伤的同时，还能防治重症患者并发症的发生、发展，充分体现了中药“多成分-多靶点”作用机制的复杂性及其药理学作用的多效性和广泛性，说明了抗COVID-19方剂中配伍甘草入药的原因。本研究中仅采用虚拟对接技术分析，具有一定局限性，还需进行试验验证。