曾奇璐，苏泰安，贺桢翔，赵灵丽，郑荣蕾，刘 涛△

（1.西南交通大学生命科学与工程学院，四川 成都 611756； 2.太极集团重庆桐君阁药厂有限公司，重庆 401336； 3.成都大学药学与生物工程学院，四川 成都 610106）

急性上呼吸道感染由细菌以外病原体引发，以病毒感染最常见[1]，病毒通过入侵鼻咽喉，破坏呼吸道上皮细胞，引起咽黏膜充血，伴有黏液性和浆液性炎性渗出等[2]。感冒属中医“温病”“温疫”“伤风”“伤寒”等范畴，其病机有六淫致病之说，《素问·至真要大论》载“夫百病之生也，皆生于风寒暑湿燥火”，提出外邪致病因素有风、寒、暑、湿、燥、火6种[3]；“六淫之邪无毒不犯人”，也可兼夹而生，常见有风寒、温热、暑湿等类型[4]。不同类型的感冒有相应的发生、传变规律，中医强调辨证论治。三仁合剂是根据温病大家吴鞠通《温病条辨》中三仁汤转剂型而来，由苦杏仁、豆蔻、薏苡仁、滑石、淡竹叶、姜半夏、通草及厚朴组方。苦杏仁宣利上焦肺气、气行则湿化，豆蔻芳香化湿、行气宽中、畅中焦之脾气，薏苡仁甘淡性寒、渗湿利水而健脾、湿热从下焦而去，三仁合用，三焦分消，为君药；滑石、通草、竹叶甘寒淡渗，加强君药利湿清热之功效，为臣药；半夏、厚朴行气化湿，散结除满，为佐药。全方具有宣化畅中、清热利湿功效。现代研究表明，水通道蛋白（AQPs）的异常表达可能是湿热证的发生机制之一[5]，三仁汤可能影响AQPs在机体中的表达，从而防治呼吸系统疾病。赖鹏华等[6]发现，三仁汤可能通过促进肺组织AQP5表达，导致MUC5AC分泌抑制，阻止湿热环境下呼吸系统疾病的气道黏液高分泌状态持续发展。三仁汤能较好地调节湿热证、湿偏重证大鼠机体中AQP2和AQP3的表达，对炎性损伤有修复作用，有助于恢复体内水液代谢平衡[7-8]。三仁汤有助于上呼吸道感染等外感疾病的治疗[9-10]。网络药理学是系统生物学的组成部分，其整体观与系统性同中医药的配方组合、辨证论治原则相符合，运用网络药理学挖掘中药化学成分与相关靶标有助于从分子网络水平阐释中药的作用机制和药效物质基础，也有助于多靶点药物的开发和老药新用的发现[11-13]。分子对接是指通过电脑模拟将小分子（配体）放置于大分子靶标（受体）的结合区域，再通过计算物理化学参数，从而达到预测两者的结合力（结合亲和性）和结合方式（构象）的一种理论模拟方法[14]。本研究中以临床应用为依据，通过网络药理学与分子对接技术探求药物发挥药效的作用机制，为临床合理应用三仁合剂提供参考。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 三仁合剂中活性成分及靶蛋白的虚拟筛选

在中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP[15]（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以“苦杏仁”“豆蔻”“薏苡仁”“滑石”“淡竹叶”“姜半夏”“通草”“厚朴”为关键词，检索其化学成分信息。口服生物利用度（OB）是指制剂中药物被吸收后进入人体循环的速度与程度，反映所给药物进入人体循环的药量比例，是评价药物能否发挥药效的重要指标[16]，可反映药物的生物活性分子的类药性（DL）。DL值是化学成分在机体中产生活性的重要参数[17]。考虑三仁合剂为口服的给药形式，设定OB≥30%且DL≥0.18，检索出其活性成分，并在“Related Targets”功能中预测获得相应化学成分靶蛋白。将受体名称上传至Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/），限定物种为“Human”，转换得到UniprotID及受体-基因名。

1.2 疾病基因获取及韦恩图构建

从GeneCards数 据 库（https://www.genecards.org/）中获取疾病相关基因，选择得分排名前300的基因作为该疾病的靶基因。将上述“成分-靶点”“疾病-靶点”导入Venny 2.1.0网站（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），获得交集基因。

1.3 靶标通路富集分析及绘图

将上述交集基因导入DAVID数据库[18]（https://david.ncifcrf.gov/），设定物种为“Homo sapiens”，点击Clear all，分别选择Gen Ontology中的GOTERM BPDIRECT，GOTERM CC DIRECT，GOTERM MF DIRECT和Pathways中的KEGG PATHWAY，进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并获得分析结果。将termdescription和observed gene count分别作为纵、横坐标绘图，GO功能富集分析结果用GraphPad Prism 6.0绘图软件绘制柱状图；KEGG通路分析结果用Omicshare数据 库（http://www.omicshare.com/tools/index.php/）绘制高级气泡图。

1.4 蛋白互作（PPI）网络与成分-靶点通路的构建

将不重复的基因导入String数据库（https://stringdb.org/cgi/input.pl），选择物种为“Homosapiens”，获得蛋白相互作用关系网络。将成分、靶点导入Cytoscape Version 3.7.0软件，构建“成分-靶点”网络。以大于2倍度中心性（degree）的中位数为标准，通过网络拓扑参数筛选关键节点，预测三仁合剂治疗湿热型上呼吸道感染活性化合物的潜在物质基础。

1.5 成分-靶点分子对接

通过RSCB数据库[19]（https://www.rcsb.org/）下载得到肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、血管内皮生长因子A（VEGF-A）及（Flu A）M2，（Flu A）HA靶标蛋白，以pdb格式保存其3D结构，使用Discovery Studio软件去除靶蛋白配体和水分子等非蛋白分子。通过PubChem数 据 库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得baicalein，luteolin，quercetin化合物结构的sdf格式文件。通过ZINC数据库（http://zinc15.docking.org/）获得药物化合物的sdf格式文件。将去水加氢后的蛋白质及化合物上传至PyRx软件，刚性化蛋白质分子，再上传化合物，使其能量最小化，更改文件格式为pdbqt，最后运用vina进行对接。以结合能≤-5.0 kJ/mol为标准筛选能与靶标蛋白自发结合的药物活性分子[20-21]。

2 结果

2.1 三仁合剂活性成分

共得到三仁合剂的活性成分52个，其中苦杏仁19个，豆蔻12个，薏苡仁5个，姜半夏11个，通草3个，厚朴2个，数据库中均未查到滑石、淡竹叶的化学成分。详见表1。

表1 三仁合剂中52个活性成分的基本信息Tab.1 The basic information of 52 active components in Sanren Mixture

2.2 成分-靶点网络构建

将52个活性成分导入TCMSP数据库，共获得775个靶点，通过Uniprot校正后得到229个不重复的基因。从GeneCards数据库中获得疾病相关基因1 191个，选择相关性较高的前300个基因作为疾病基因，以Venn 2.1.0为工具取得交集基因62个。详见图1。

图1 交集基因韦恩图Fig.1 Venn diagram of intersection genes

通过Cytoscape 3.7.0构建了成分-靶点网络，共38个节点，171条边。详见图2。其中红色为化合物成分，绿色为作用靶点，红边代表靶点间的作用关系，蓝边代表化合物与靶点间的作用关系。Degree是在网络分析中刻画节点中心性（Centrality）最直接的度量指标。通过Degree排序可确定关键节点，Degree越大在整个网络中的枢纽性越强[22]，Degree≥2倍中位数（中位数成分=1.5，中位数靶标=7）的成分分别为MOL000098-槲皮素（quercetin）、MOL000006-木 犀 草 素 （luteolin）、MOL002714-黄芩素（baicalein）。其中，槲皮素、木犀草素来源于君药豆蔻，黄芩素来源于半夏。靶标有TNF-α，IL-6，VEGF-A，均为炎症有关靶标[23-25]。

图2 三仁合剂成分-靶点网络Fig.2 Components-targets network of Sanren Mixture

2.3 通路富集分析

DAVID数据库中，GO功能富集分析得到GO条目1 555个，其中生物过程（BP）条目1 347个，细胞组成（CC）条目73个，分子功能（MF）条目135个。详见图3。选择KEGG通路富集分析结果的前20条绘制高级气泡图，主要有糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、流体剪切应力与动脉粥样硬化通路（Fluid shear stress and atherosclerosis）、致 癌 通 路（Pathways in cancer）、疟疾（Malaria）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）等。详见图4。

图3 三仁合剂靶标的GO功能富集分析Fig.3 GO enrichment analysis of the targets of Sanren Mixture

图4 三仁合剂作用靶点KEGG通路富集分析的20条通路Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis of 20 pathways of targets of Sanren Mixture

2.4 分子对接结果

将三仁合剂中的关键成分、抗病毒西药与抗炎抗病毒相关受体对接，关键化合物中黄芩素与VEGF-A受体、（Flu A）M2、（Flu A）HA的结合能最低，分别为-26.36，-36.40，-38.91 kJ/mol；木犀草素与TNF-α的结合能最低，为-37.24 kJ/mol；槲皮素与IL-6的结合能最低，为-28.03 kJ/mol。药物配体与蛋白受体的结合能越低，越容易结合。结果见图5和表2。

表2 三仁合剂中核心化合物及临床治疗药物与疾病相关靶点的结合亲和力Tab.2 The binding affinity of the core compounds in Sanren Mixture and clinical therapeutic drugs with disease-related targets

图5 疾病相关靶点与槲皮素、木犀草素及黄芩素的分子对接模式Fig.5 Molecular docking patterns of disease-related targets with quercetin，luteolin and baicalein

3 讨论

急性上呼吸道感染多由病毒引起，占门急诊患者的1/3以上。突发性传染病严重急性呼吸综合征（SARS）、甲型流感（H1N1）及严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV-2）均从口鼻而入，首袭犯肺，与中医学理论描述的温病疫毒传播方式相似，被归为“湿疫”[18-20]。中医认为，呼吸道感染与湿热有相关性。叶天士认为，“肺位最高，邪必先伤”“温邪上受，首先犯肺”，其病机关键在于湿毒疫邪侵袭犯肺、损其脾胃。薛生白《湿热篇》中提到：“太阴内伤，湿饮停聚，客邪再至，内外相引，故病湿热。”提示湿热证来源于脾胃受损，致使外湿不散、内湿不运，加上疫毒病气侵袭，内外牵引。三仁合剂具有宣上、畅中、渗下之效，有助于脾胃运化、宣降肺气、祛湿透邪。

网络药理学研究中，TCMSP数据库中未收录三仁合剂方中矿物药滑石和植物药淡竹叶成分。滑石的成分主要为含水硅酸镁，有导热下行之效[26]。因此，将含水硅酸镁与TNF-α，IL-6，VEGF-A，（Flu A）M2，（Flu A）HA靶点分别进行分子对接，结果显示，同其余化合物成分相比，与靶点的结合能力较弱，将其纳入三仁合剂发挥药效的潜在重要化合物，后期将进一步研究。淡竹叶可清热、除烦、利尿，从多个部位提取分离得黄酮类、多糖类、芦竹素、白茅素、无羁萜、豆甾醇等成分，但对其发挥药效的物质基础的研究鲜有报道[27]。由于TCMSP数据库收载不完整，且各数据库间筛选标准及算法不一致，故未将滑石、淡竹叶纳入三仁合剂治疗湿热型感冒的核心活性化合物。

由网络药理学分析结果可知，排前3名的核心化合物（槲皮素、木犀草素、黄芩素）均为黄酮类成分。通过整理分子对接机制结果，参与分子对接结合的槲皮素、木犀草素、黄芩素3种化合物均为能与靶标蛋白自发性结合的药物活性物质，其中黄芩素与VEGF-A受体、（Flu A）M2、（Flu A）HA的结合能最低，木犀草素与TNF-α的结合能最低，槲皮素与IL-6的结合能最低。与临床推荐使用的急性上呼吸道感染药物利巴韦林、奥司他韦相比，这些成分与TNF-α，IL-6，VEGF-A，（Flu A）M2，（Flu A）HA靶点的结合能更低，更易结合。通过分子对接2D图可知，药物关键成分通过范德华力、传统氢键和π-π堆积等键力作用与抗炎、抗病毒相关靶点结合，一些氨基酸残基可能成为药物成分与其发挥作用的活性位点。随着中医在治疗呼吸道疾病中应用的逐渐扩大，不断挖掘治疗急性上呼吸道感染活性化合物的潜在物质基础，探讨潜在活性化合物与治疗靶点的作用内涵，有利于更系统、全面地揭示中药活性成分发挥药效的潜在分子机制，以及应对病毒多样化、复杂化的趋向。

综上所述，结合临床应用，通过网络药理学和分子对接技术，发现了三仁合剂发挥药效的潜在活性化合物槲皮素、木犀草素、黄芩素，以及治疗湿热型感冒的作用机制。鉴于网络药理学存在数据库采集信息不全面、未考虑实际化合物含量等问题，分析结果具有一定局限性。