李晋南，张圆圆，范泽，吴迪，王连生

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江省水生动物病害与免疫重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150070）

精氨酸（Arg）作为功能性氨基酸在机体的各种生理活动中起重要作用，如促进蛋白质代谢、提高机体的免疫力、促进激素的分泌、提高繁殖力等，此外还是多种活性物质的前体[1-3]。Arg 是鱼的必需氨基酸。不同鱼对精氨酸的需求量为1.0%～3.1%，相当于日粮蛋白的3.8%～8.1%[4]。Chen 等[5]认为，建鲤（Cyprinus carpio var.Jian）对精氨酸的需求为日粮蛋白质的5.29%。Arg 在哺乳动物中的研究较多[6,7]；饲料中添加精氨酸可以提高鱼的增重率，降低饵料系数，提高蛋白质效率[8-10]。

精氨酸具有多种生理功能，尤其是在促进机体的抗氧化和免疫功能方面受到了广泛关注[11]。精氨酸可以提高大鼠的抗氧化酶活性，降低丙二醛含量，减少氧化应激对机体的损伤[12]。目前，关于饲料中精氨酸水平对鲤幼鱼肠道功能及抗氧化能力影响的研究报道尚不多见。松浦镜鲤是在德国镜鲤选育系（F4）的基础上选育出的具有很高经济价值的新品种。本研究通过在饲料中添加不同水平的精氨酸，研究其对松浦镜鲤生长性能及肠道健康的影响，以期为精氨酸在配合饲料中的应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

实验用松浦镜鲤初始体质量为（6.84±0.02）g，来自中国水产科学院黑龙江水产研究所呼兰实验站。

L-精氨酸购自Sigma，纯度≥98.5%。实验饲料蛋白源为鱼粉和酪蛋白，脂肪源为鱼油和豆油，精氨酸添加水平为0%（A0）、0.6%（A0.6）、1.2%（A1.2）、1.8%（A1.8）和2.4%（A2.4）；用甘氨酸调节氮平衡，配制5 种蛋白质含量为32.24%、脂肪含量为6.12%的等氮等能饲料。将配制并混匀后的饲料加入鱼油和豆油，再次混匀过筛后，加适量的水制成颗粒饲料。实验饲料配方及营养组成见表1[13]。

表1 基础饲料配方及营养组成（干重）Tab.1 Ingredients and approximate composition in the basal diets（air-dry basis）/%

1.2 方法

选择规格一致，体质健壮的松浦镜鲤360 尾，预饲14 d 后随机分为5 组，每组4 个重复，每个重复18 尾，饲养在室内体积为200 L 的控温循环水族箱中，24 h 不间断供氧，分别饲喂上述含精氨酸的5种饲料8 周。实验水温为（23±1）℃，溶解氧浓度＞5 mg/L，氨氮＜0.02 mg/L，pH7.05～7.20，每周换去水族箱内2/3 水，注入已曝气的水。每天8:00、12:00 和17:00 定时投喂3 次，以饱食无残饵为准，每日清除缸内粪便，记录鱼摄食和死亡情况。

养殖实验结束时，停食12 h，称量末重，统计存活数。每缸随机取3 尾鱼，经M-222 麻醉后，称量体质量和体长，迅速在冰盘中解剖，取出肠道后测量肠质量和肠长。分别取0.5 cm 的前肠、中肠和后肠组织段固定于Bouin 氏液中，保存在4℃冰箱中，用于后续肠道组织结构分析。剩余的各肠段样品分装于密封袋中，保存于-40℃冰箱中，用于测定消化酶活性和抗氧化指标。

肠道消化酶的测定：将前中后肠的组织样品用0.86%生理盐水制成10%的组织匀浆液，离心取上清液后，分装于1.5 mL 离心管存于-20℃冰箱中备用[13]。

淀粉酶和脂肪酶活性采用南京建成生物工程研究所的试剂盒，按说明书测定。利用福林-酚（Folin-phenol）法测定蛋白酶活性，考马斯亮蓝法测定组织中蛋白含量[13]。

肠道抗氧化指标的测定：超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、一氧化氮合酶（NOS）活性与谷胱甘肽（GSH）、总抗氧化能力（T-AOC）及丙二醛（MDA）含量均采用南京建成试剂盒，参照试剂盒说明书测定。

肠道组织结构的测定与观察：肠道组织样品从Bouin 氏液取出后，经乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片机切成厚度为5 μm 切片、HE 染色制成肠道组织切片。在带有拍照系统的光学显微镜下（Leica MD 4000B）观察并拍照，用Motic Images Plus 2.0 软件对每个肠段的皱襞高度、绒毛宽度和肌层厚度等指标进行测量，每张切片测量10 个以上，取其平均值进行分析。

1.3 统计分析方法

根据实验鱼初体质量、末体质量、体长、肠质量和肠长，计算特定生长率（specific growth rate，SGR）、肠体指数（Intestinal somatic index，ISI）和肠长指数（Intestinal length index，ILI）。

特定生长率（SGR）=（Ln末体质量－Ln初体质量）×100/天数;

肠体指数（ISI）=肠质量/体质量×100%；

肠长指数（ILI）=肠长/体长×100%。

数据用平均值±标准差（x±SD）表示，利用SPSS19.0 统计软件进行单因素方差分析和Duncan’s 多重比较，显著性水平P 为0.05。

2 结果与分析

2.1 饲料精氨酸水平对松浦镜鲤幼鱼生长性能的影响

由表2 可知，添加精氨酸各组松浦镜鲤的末体质量（FBW）和特定生长率（SGR）显著高于对照组（P＜0.05）；A1.2 组和A1.8 组肠体指数显著高于A0组（P＜0.05）；A1.8 和A2.4 组的肠长指数显著高于A0 组（P＜0.05）。

表2 摄食不同精氨酸水平饲料的松浦镜鲤的生长性能Tab.2 Growth performance of juvenile Songpu mirror carp fed diets containing various levels of arginine

2.2 饲料精氨酸水平对松浦镜鲤幼鱼肠道消化酶活性的影响

由表3 可知：饲料中添加精氨酸对中肠蛋白酶活性没有显著影响（P＞0.05），添加2.4%精氨酸组前肠蛋白酶活性显著高于A0、A0.6 和A1.2 组（P＜0.05），A1.8 和A2.4 组后肠蛋白酶活性显著高于A0 组（P＜0.05）；饲料中添加精氨酸对后肠脂肪酶活性没有显著影响（P＞0.05），A1.8 和A2.4 组前肠和中肠脂肪酶活性显著高于A0 组（P＜0.05）；饲料中添加精氨酸对前肠和后肠淀粉酶活性没有显著影响（P＞0.05），A1.8 组中肠淀粉酶活性显著高于A0 组（P＜0.05）。

表3 摄食不同精氨酸水平饲料的松浦镜鲤肠道消化酶的活性Tab.3 Intestine digestive enzyme activities of juvenile Songpu mirror carp fed diets containing various levels of arginine

2.3 饲料精氨酸水平对松浦镜鲤幼鱼肠道抗氧化能力的影响

由表4 可知，A1.2 组松浦镜鲤前肠和中肠CAT活性显著高于A0 组（P＜0.05），而后肠CAT 活性各组间没有显著差异（P＞0.05）。A2.4 组前肠T-AOC显著高于其他各组（P＜0.05），且其后肠T-AOC 显著高于A0 组（P＜0.05），A1.8 组中肠T-AOC 显著高于A0 组和A0.6 组（P＜0.05）。各实验组间MDA 含量差异不显著（P＞0.05）。A2.4 组前肠SOD 活性显著高于其他各组（P＜0.05），其中肠SOD 活性显著高于对照组（P＜0.05），各添加组后肠SOD 活性显著高于对照组（P＜0.05）。A1.8 和A2.4 组前肠GSH 含量显著高于对照组（P＜0.05），A2.4 组中肠GSH 含量显著高于A0、A0.6 和A1.2 组（P＜0.05），A1.2、A1.8 和A2.4 组后肠GSH 含量显著高于A0 组（P＜0.05）。A2.4 组前肠和中肠NOS 活性显著高于其他各组（P＜0.05），各添加组后肠NOS 活性显著高于对照组（P＜0.05）。

表4 摄食不同精氨酸水平饲料的松浦镜鲤的肠道抗氧化能力Tab.4 Intestine digestive antioxidant capacity of juvenile Songpu mirror carp fed diets containing various levels of arginine

2.4 饲料精氨酸水平对松浦镜鲤肠道形态的影响

饲料中添加精氨酸显著影响了肠道的皱襞高度，肠绒毛宽度和肌层厚度。由图1 可知：添加精氨酸显著增加了松浦镜鲤前肠皱襞高度（P＜0.05），与A0 组相比，添加1.8%和2.4%精氨酸显著提高了中肠和后肠的皱襞高度（P＜0.05）。各组前肠和后肠绒毛宽度差异不显著（P＞0.05），与A0 组相比，添加1.8%和2.4%精氨酸显著增加了中肠的绒毛宽度（P＜0.05）。前肠肌层厚度各实验组间差异不显著（P＞0.05），A1.2 组中肠肌层厚度显著高于其他各组（P＜0.05），A1.8 组后肠肌层厚度显著高于A0 组（P＜0.05）。

图1 饲料中精氨酸水平对松浦镜鲤肠道形态的影响Fig.1 Effects of dietary arginine levels on the intestinal morphology of Songpu mirror carp

3 讨论

精氨酸参与体内蛋白质和多胺的合成，可以提高鱼类的生长性能[8-10,14-16]。本实验中，饲料中添加0.6%以上的精氨酸，显著提高了松浦镜鲤幼鱼的末质量和SGR，但各添加组间差异不显著，说明饲料中添加0.6%左右的精氨酸便可以显著提高松浦镜鲤幼鱼的生长性能，过量的精氨酸对松浦镜鲤的生长没有显著的促进作用。对黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）[17]和尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus L.）[8]的研究表明，其生长性能随着饲料精氨酸水平的进一步增加而呈下降趋势，其可能是存在精氨酸与赖氨酸的拮抗作用。

鲤无胃，肠道是消化和吸收营养物质的重要场所。机体对营养物质的消化吸收能力以肠道中的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性来衡量[18]。精氨酸及其代谢产物能提高肠道中消化酶活性，提高鱼类的生长速度[16,19]。对建鲤的研究表明，饲料中精氨酸水平对淀粉酶活性无显著影响，但显著提高了蛋白酶和脂肪酶活性[5]。Zhou 等[19]对黑鲷（Acanthopagrus schlegelii）幼鱼的研究表明，精氨酸可以提高鱼体前肠和中肠胰蛋白酶活性，以及前肠淀粉酶活性。对仿刺参（Apostichopus japonicus）的研究表明[20]，饲料精氨酸水平可以显著影响肠道蛋白酶的活性，而对脂肪酶和淀粉酶活性影响不显著。饲料中添加精氨酸显著提高了杂交鲟（Acipenser schrrenckii ♀×A.baeri ♂）前肠蛋白酶和淀粉酶活性[21]。对黄颡鱼幼鱼的研究表明，适宜水平的精氨酸可以提高胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性及肝脏淀粉酶活性[21]。本研究同样表明，精氨酸能够通过提高松浦镜鲤肠道的消化酶活性，从而提高营养物质的吸收和利用。

SOD、CAT 及GSH 是生物体内广泛存在的抗氧化酶，可以有效清除活性氧自由基以保护机体组织免受损伤[22,23]。MDA 是脂肪氧化的终产物之一，能够反映机体细胞受损伤程度[24]。总抗氧化能力（T-AOC）与机体的健康程度密切相关。本实验中，饲料中添加适宜水平的精氨酸增加了松浦镜鲤幼鱼肠道T-AOC、SOD 和CAT 活性，提高了GSH 含量和肠道的抗氧化能力。这一结果与吴俊光等在鲟鱼上的研究结果一致[25]。饲料中精氨酸水平能显著提高斑点叉尾（Ictalurus punctatus）肝脏中SOD活力[26]。精氨酸是体内多胺、一氧化氮等活性物质合成的前体，其能够在NOS 的催化下生成一氧化氮（NO），而NO 具有杀菌和抑菌作用，可以清除机体内的氧自由基[27]，提高抗氧化酶的活性。封福鲜等[28]的研究表明，瓦氏黄颡鱼（Pelteobagrus vachelli）血清NOS 活性随Arg 水平的升高而升高。在本实验中，随着饲料中精氨酸水平的增加，肠道NOS 活性显著增高，进一步增强了鱼体的免疫力。

影响鱼类消化吸收能力的不仅仅是肠道消化酶活性，肠道本身形态结构及发育情况同样影响鱼类对营养物质的消化吸收[29]，其中影响鱼类肠道消化吸收能力的重要指标包括肠道皱襞的高度、密度及排列状态等[30,31]。精氨酸能显著提高杂交鲟幼鱼前肠的皱襞高度、绒毛高度和肌层厚度，以及中肠的皱襞高度[20]。在美国红鱼（Sciaenops ocellatus）和杂交条纹鲈（Morone chrysops×Morone saxatilis）的研究中也发现了类似的结果[16,32]。随精氨酸添加水平的升高，斜带石斑鱼（Epinephelus malabaricus）前中后肠的肌层厚度、皱襞高度均升高[33]。本实验得到了相似的结果，适宜水平的精氨酸对松浦镜鲤肠道皱襞高度、绒毛宽度和基层厚度都有显著的改善。这说明精氨酸可以通过促进肠道的发育，提高肠道对营养物质的吸收能力，从而促进鱼体的生长。此外有研究表明，精氨酸可以增加肠道重量[34,35]，这与本实验结果一致，进一步说明了精氨酸可以促进肠道的健康发育。

综上，精氨酸可以显著提高松浦镜鲤肠道的消化吸收功能及肠道的发育，适宜的添加水平为1.8%～2.4%。