苑 霖,王新珍,孙宏勇,刘小京,刘彬彬**

(1.中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心 石家庄 050022;2.中国科学院大学 北京 100049)

土壤盐渍化是土地退化的主要原因之一,盐渍化影响作物生长,降低粮食产量,严重威胁农业生产和粮食安全[1]。据估计,全世界约有8000 万hm2耕地受到土壤盐渍化的影响[2]。我国盐渍化土壤具有面积大、分布广的特点,严重威胁区域农业的发展[3]。近年来,盐碱地改良与治理技术逐渐发展起来,种植耐盐作物被认为是开发和利用盐渍化土壤的有效途径,且作物育种领域培育出了一系列的耐盐作物新品种,为盐碱地的利用提供了种质资源[4-5]。

小麦(Triticum aestivum)是我国主要粮食作物之一,2020年统计结果显示,我国小麦种植面积2338万hm2,占全国粮食种植面积的20%[6]。近年来,我国耐盐小麦育种也取得了一系列进展:为适应渤海经济区的发展,李振声课题组选育了适合在河北省中南部冬麦区种植的耐盐小麦品种‘小偃81’,2007年的检测结果显示其耐盐性显著优于普通小麦品种[7];赵松山等[8]通过有性杂交,在逆境与非逆境交替的条件下选育出小麦品种‘沧6001’,该品种具有抗旱、耐盐、抗寒、优质、丰产稳产等特点;于亮等[9]通过水、旱条件交替,将‘临汾6154’与‘冀麦32’杂交,选育出4 个具有耐盐抗旱特性的小麦品种。然而随着世界人口的增长,对粮食的需求也逐渐增加,以粮食增产为目的的各种技术发展起来,传统作物育种是基于对作物基因组控制的性状改良,而目前一些科学家正试图通过调节植物微生物组来提高作物产量,以满足日益增长的粮食需求[10]。实现这一目标的前提是明确植物-微生物互作机理,而这一领域的研究目前仍处于起始阶段。

植物生长发育的过程中,通过根系从培养介质中摄取营养和水分,同时也向生长基质中分泌出大量有机物,即根系分泌物[11]。根系分泌物是根际土壤微生物低分子养分的主要来源,其组成与变化影响着根际微生物的群落构成[12]。同时,植物也通过调控根系分泌物来适应和抵御不良环境。根系分泌物中的有机酸具有至少一个羧基、能够携带负电荷、可以络合土壤溶液的阳离子或者置换土壤母质中的阴离子,从而影响植物和微生物对养分的吸收及固定、植物对逆境的抗性、微生物在根际的定殖等一系列过程[13]。研究表明,低分子量有机酸能通过不同方式(还原、螯合、酸化、离子交换)溶解和转化部分难溶性的矿物,还可以通过调节根表细胞的通透性,来释放和提高根际养分的生物有效性,进而促进植物对养分的吸收、促进植物生长发育[14-15]。

根际微生物研究的主要目的之一是充分挖掘根际微生物资源,开发生物肥料,减少农药化肥的使用,促进农业可持续发展[16]。植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)是指存在于植物根际,对植物生长有促进作用的有益细菌的统称,国内外已发现多个种属的根际微生物具有促生潜能[17]。PGPR 具有解磷、解钾、固氮等多种生理功能,能够分泌植物生长调节物质,促进植物根系生长,从而促进植物对土壤中养分的吸收[18]。同时,PGPR 可产生多种外源植物激素,研究最广泛的是植物生长素(IAA),IAA 能够在一定浓度范围内使植物细胞生长,根系进一步发育,从而促进植物生长[19]。研究发现,某些植物根系能够分泌大量的有机酸,进而激活难溶性磷从而满足植物自身生长发育的需要[20-21]。

王新珍等[22]分离纯化的克锡勒氏菌Kushneria indalininaJP-JH 菌株,具有较强的耐盐、耐碱特性,能在1%～15%质量浓度的盐胁迫下生长,并能分泌植物生长素吲哚乙酸(IAA),在一定盐胁迫下促进作物生长。因此本试验选择耐盐小麦品种‘小偃60’,在其幼苗根部接种根际促生菌JP-JH,从根系分泌有机酸的角度探讨克锡勒氏菌JP-JH 对小麦幼苗生长及抗盐性的影响,为充分挖掘根际微生物资源,开发生物肥料提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试小麦及菌株

供试小麦品种为耐盐抗旱小麦品种‘小偃60’。‘小偃60’是以‘小偃54’和‘鲁麦13’为亲本,经过有性杂交、系统选择,是适合在环渤海低平原盐碱麦区种植的耐盐抗旱小麦新品种[23]。所用菌种JP-JH 是王新珍等[22]前期从盐地碱蓬(Suaeda salsa)根际土壤筛选分离得到,具有较强的耐盐、耐碱性,能分泌植物生长素吲哚乙酸。

1.1.2 培养基

液体培养使用液体LB 培养基,固体培养采用加入2%琼脂的LB 固体培养基;植物溶液培养采用霍格兰(Hoagland HB8870-1)培养液,购自青岛海博生物公司。

1.1.3 液相色谱试验材料

高效液相色谱试验采用色谱纯级的有机酸标准物,草酸(oxalic acid)、酒石酸(tartaric acid)、琥珀酸(succinic acid)购自Sigma 公司。苹果酸(DL-malic acid)、柠檬酸(citric acid)、富马酸(fumaric acid)购自中国食品药品检定研究院。有机相:乙腈(色谱纯),格里斯(天津)医药化学技术有限公司。流动相:磷酸二氢钾(色谱纯),上海源叶生物科技有限公司。微孔滤膜(水系,0.45 μm),天津市津腾实验设备有限公司。液相色谱试验用水为超纯水。

1.1.4 主要仪器和设备

采用的高效液相色谱仪(Waters e2695)配备2998 型光电二极管阵列检测器(Waters),Atlantis T3 C18 色谱柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm,Waters)。根系分泌物浓缩采用北京博医康实验仪器有限公司生产的冷冻干燥机。植物培养使用智能人工气候箱PRX-1000D,产自宁波赛福实验仪器有限公司。

1.2 小麦培养与取样

1.2.1 浸种与育苗

选取大小一致、颗粒饱满、健康无病害的小麦种子,用去离子水洗涤3 遍,在水中浸泡6～8 h 后,用次氯酸钠溶液(有效氯2%)浸泡20 min,再用灭菌去离子水清洗3 次。在直径9 cm 的培养皿上放置2 层灭菌滤纸,将表面消毒后的小麦种子置于其上,每皿50 粒种子,每个培养皿加入10～15 mL 去离子水。2～3 d 后选取出苗整齐的种子移栽到定植绵中,在营养液中培养。

1.2.2 菌悬液制备

取−80 ℃甘油管保藏的K.indalininaJP-JH 菌液,接种于LB 液体培养基中,振荡培养进行活化。待K.IndalininaJP-JH 菌株活化后,在LB 固体培养基上划线培养48 h,取单菌落接种到装有100 mL LB 液体培养基的250 mL 三角瓶中,于28 ℃、150 r·min−1条件下震荡培养24 h。然后将培养物8000 r·min−1离心10 min,弃上清,收集菌体。按上述离心条件用无菌水洗涤3 次,并用无菌水调节菌液,使其在波长600 nm下的OD 值为0.6 左右。

1.2.3 溶液培养

设置无盐、低盐和高盐3 个盐浓度梯度,即配制NaCl 浓度为0 mmol·L−1(无盐)、200 mmol·L−1(低盐)、400 mmol·L−1(高盐)的霍格兰营养液。待小麦种子萌发(发芽标准以根长等于种子的长或者芽长等于种子长的一半为标准)后,以定植棉固定,放入400 mL 上述不同盐浓度的营养液中,处理组加入菌悬液20 mL,对照组加入清水20 mL。每个处理3 次重复,每个重复10 株苗,每7 d 更换一次营养液+菌悬液/清水。昼夜周期为:光照16 h,黑暗8 h;培养温度为:昼25 ℃左右,夜20 ℃左右。

1.3 根系分泌物收集与处理

在小麦移苗40 d 后,于光照充足的上午,用灭菌去离子水淋洗根部3～5 次,在5 mg·L−1百里酚溶液中浸泡3 min,减少来自营养液中物质的污染,然后用滤纸吸干根表面水分,将小麦幼苗移至500 mL 0.5 mmol·L−1的CaCl2溶液中,使根部处于黑暗状态收集4 h,将获得的溶液定容至500 mL。在本研究中我们将该方法得到的收集物定义为根系分泌物。值得注意的是该收集物与水培过程中的分泌物并不完全相同,但能够反映出不同处理植物因生理状态不同而导致的产生根系分泌物能力的差别。‘浸根法’也在前人的研究中被广泛使用[24-25]。收集的根系分泌物在4 ℃冰箱保存,为便于测量,对分泌物进行浓缩,根系分泌物首先过0.45 μm 滤膜过滤,取40 mL滤液放入50 mL 离心管中,于−20 ℃冷冻为固态,通过真空冷冻干燥机干燥浓缩至干粉状态,于−20 ℃保存[26-27]。

1.4 根系分泌物中有机酸的高效液相色谱测定

1.4.1 色谱条件

色谱柱:Atlantis T3 C18色谱柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm);流动相:0.08 mol·L−1KH2PO4(pH=2.5);流速1.0 mL·min−1;进样体积20 μL;进样时间20 min,柱温35 ℃,检测波长210 nm。

1.4.2 流动相和有机酸标准品的制备

精确称取10.8872 g 色谱纯级别的KH2PO4固体粉末,放入1 L 容量瓶中定容,配制成0.08 mol·L−1KH2PO4溶液,用磷酸调节pH 至2.5,过0.45 μm 滤膜,以去除杂质作为流动相。试验前进行10 min 超声脱气,去除溶液中的气泡,使测量基线稳定。

准确称取草酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸100 mg,于10 mL 容量瓶中,加水溶解并定容至10 mL,得到10 mg·mL−1的标准酸母液,−4 ℃保存作为储备液。以流动相对母液进行稀释,配制不同浓度的草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸,过0.45 μm 微孔滤膜后作为标准样品,同时制备不同浓度的标准混合酸。

1.4.3 有机酸测定

取40 mL 冻干浓缩的干粉状收集物,用流动相溶解定容至5 mL,过0.45 μm 微孔滤膜,取1.5 mL 滤液置于2 mL 豁口进样瓶中。将标准有机酸样品按照浓度由低到高的顺序进样测定,确定各标准酸出峰时间。再将标准样品混合酸按照浓度由低到高的顺序进样测定,由单标准酸保留时间定性。通过Empower 3 软件,以色谱工作站中增强型积分法测量峰面积,以对应组分的峰面积对其浓度绘制外标曲线。待测样品进样后,以各组分在色谱图中的保留时间定性,通过外标法定量计算各样品溶液中不同有机酸浓度[28-29]。

1.5 植物生理指标测定

待采集根系分泌物后,用滤纸吸干植株表面水分,去除残留的小麦种子,剪去根部,用电子天平称量其地上部分重量,记为鲜重。用尺子测量从根基部到叶顶端的距离,标记为株高。将剪去根部的小麦幼苗,整株装入提前烘至恒重的牛皮纸质信封中,置于80 °C 烘箱中,烘干至恒重,用电子天平称量其重量,记为干重。

1.6 数据统计分析

采用Empower 3 通过标准样品绘制外标曲线,对待测样品进行定性、定量分析。采用Microsoft Excel 2019 对数据进行整理,通过SPSS 26.0 软件进行显著性分析,使用Origin 2018 进行绘图。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱条件与标准品的测量

经过预试验的优化,确定高效液相色谱的试验条件为:流速1.0 mL·min−1;进样体积20 μL;进样时间20 min,柱温35 ℃,检测波长为210 nm。

流动相为0.08 mol·L−1KH2PO4(pH=2.5)溶液,利用上述试验条件得到标准样品混合酸的高效液相色谱图(图1)。

由图1 可见,在选定色谱条件下,标准有机酸按照保留时间的出峰顺序分别为草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸,标准酸的保留时间及线性关系见表1。

表1 标准有机酸保留时间与线性回归方程Table 1 Retention times and regression equations of the organic acid standards

2.2 不同NaCl 浓度下K.indalinina JP-JH 菌对小麦生长的影响

加入耐盐促生菌K.indalininaJP-JH 组与无菌组在无盐、低盐、高盐条件下小麦的鲜重、干重、株高结果见图2。以T检验下P<0.05 为效果显著,对不同盐浓度下加菌组与未加菌组的3 种生长指标进行比较。在无盐、低盐与高盐胁迫下,添加K.indalininaJP-JH 菌的小麦幼苗在鲜重上均显著高于未施菌组(P<0.05),无盐、低盐和高盐处理下加菌组的小麦幼苗鲜重分别增加27.36%、37.96%和24.63%。无盐与低盐时,加入K.indalininaJP-JH 组小麦幼苗干重显著高于对照组(P<0.05),分别增加27.61%和49.82%;高盐处理时小麦干重增加了7.72%,但加菌组与对照组无显著差异。而株高方面,只有在高盐胁迫下,K.indalininaJP-JH 使株高显著增加24.82%(P<0.05),无盐和低盐处理时差异不显著。

不同盐胁迫条件下,K.indalininaJP-JH 对小麦幼苗生长的促进效果也不尽相同。低盐胁迫下K.indalininaJP-JH 使小麦幼苗鲜重和干重增加量(百分比)大于无盐和高盐,这说明低盐胁迫下K.indalininaJPJH 对小麦幼苗重量的促进作用最为显著。高盐胁迫下K.indalininaJP-JH 使鲜重显著增加,但对干重的影响不显著。由此推测,添加K.indalininaJP-JH 可能会促进小麦幼苗对水分的吸收,从而使作物水分含量增加。同时,由图可以看出,即使添加JP-JH,小麦鲜重和干重仍随盐胁迫的加重而降低,说明K.indalininaJP-JH 对小麦鲜重、干重有一定的促进作用,但仍无法补偿盐胁迫对小麦的危害。只有高盐胁迫下加菌组小麦株高较无菌组增加显著,但高盐胁迫对小麦生长影响十分显著,小麦整体长势差,所以,K.indalininaJP-JH 对小麦株高的促进作用并不明显。

2.3 不同NaCl 浓度下K.indalinina JP-JH 菌对小麦根系分泌有机酸的影响

加菌与无菌处理在无盐、低盐、高盐时小麦根系分泌有机酸液相色谱测定结果见图3。由图3 可以看出,加菌与不加菌有机酸分泌的种类差别不大,均能检测到草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸和琥珀酸,且均以草酸、酒石酸、苹果酸分泌量较多,琥珀酸次之,柠檬酸、富马酸分泌量较少。

由图3 可知,加入K.indalininaJP-JH 使部分根系分泌有机酸增加,主要体现在草酸、酒石酸。无盐胁迫下加菌组除苹果酸外,有机酸分泌量较高,但与对照组无显著差异。低盐胁迫下,加菌组草酸、酒石酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸分泌量高于未加菌组,且草酸和酒石酸差异显著(P<0.05),分别增加58.95%和101.76%。高盐胁迫下,加菌组除富马酸外其余5 种有机酸分泌量均高于未加菌组,草酸和酒石酸差异显著(P<0.05),分别增加41.72%和95.63%。

由此可见,加入耐盐促生菌JP-JH 改变了小麦根系有机酸的分泌,其中低盐与高盐胁迫对草酸和酒石酸分泌的促进作用最为显著。同时,在低盐胁迫下K.indalininaJP-JH 使草酸、酒石酸分泌量增幅较大,大于高盐胁迫时的增幅。

3 讨论与结论

随着植物微生物组学的发展,根际微生物功能的研究也日渐深入。根际促生菌是指存在于植物根际,对植物生长具有促进作用的有益菌类,其与作物抗逆性密切相关,是生产生物菌肥的基本原料。一些根际微生物能够分泌外源生长激素影响植物代谢,植物也可通过根系代谢产生的分泌物活化土壤矿质养分,促进植物对难溶营养物质的吸收,影响植物在逆境下的生长发育[30-31]。为探究耐盐促生菌K.indalininaJP-JH 对禾本科粮食作物小麦苗期的作用效果,在营养液水培条件下,对小麦幼苗根际接种K.indalininaJP-JH,待生长40 d 后,对小麦幼苗的生理指标与根系分泌有机酸进行测定分析。结果表明,在无盐处理与低盐胁迫时,加入耐盐促生菌K.indalininaJP-JH 组的小麦鲜重、干重显著增加;在高盐胁迫下,加菌处理的鲜重与株高显著高于对照组。从作物的生理指标分析,根际耐盐促生菌K.indalininaJP-JH对无盐处理与盐胁迫(低盐与高盐)下苗期小麦的生长具有促进作用。根际促生菌对小麦苗期的促生效果在以前的研究中也被报道过,杨杉杉[32]对内蒙古荒漠植物根际土中分离的根际促生菌进行了研究,发现单菌和复合菌剂均对小麦苗期有明显的促生效果。

通过高效液相色谱测定根系分泌的6 种有机酸,结果表明,在无盐处理与有盐胁迫时,均检测到了草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸和琥珀酸6种有机酸。在无盐处理时,加菌组与无菌组6 种有机酸的分泌量无显著差异;在盐胁迫(低盐与高盐)时,加菌处理使得根系分泌的草酸和酒石酸显著增加,其余4 种有机酸的变化不显著。由此我们推测,在盐胁迫条件下,根际耐盐促生菌K.indalininaJP-JH 的加入,对根系部分有机酸的分泌产生影响,使得草酸、酒石酸含量显著升高。接种外源微生物促进植物生长以及改变根系分泌有机酸的现象在低磷胁迫条件下的枳实(Poncirus trifoliata)生苗生长过程中也曾被发现[33]。

有研究表明,根系分泌物中的低分子量有机酸是金属活化剂,能激活根际难溶性矿质养分,促进植物对营养的吸收与利用[34]。王树起等[35]发现缺磷胁迫会使大豆(Glycine max)分泌的草酸含量增加,而根系分泌的草酸则可以改变磷在土壤中的溶解性[36]。而本试验中,低盐与高盐条件下,耐盐促生菌K.indalininaJP-JH 使根系分泌的部分有机酸(草酸、酒石酸)含量增加,这有可能会活化土壤中锌和磷等营养物质,从而促进植物对这些养分的吸收利用。植物生理指标的改变也会反过来影响根系有机酸的分泌。Dinkelaker 等[20]发现白羽扇豆(Lupinus albus)在逆境条件下,植物会形成一种特殊的根部结构,这种结构促进根部分泌大量有机酸,从而活化土壤中的难溶性营养元素,满足自身生长需要。同时,研究表明苗期禾本科植物接种碱蓬(Suaeda glauca)内生菌能够提高叶片、根系中某些有机酸的含量,提高植物抗逆能力[37]。综上所述,本试验中加菌组小麦幼苗生理指标的改善,也可能是影响根系有机酸变化的原因,但是,还需要对根系形态以及其他相关生理指标的变化进行进一步分析。

本研究通过对小麦幼苗接种K.indalininaJP-JH菌株,揭示了K.indalininaJP-JH 菌对小麦的促生效应,以及对小麦根系分泌有机酸的影响。根际耐盐促生菌K.indalininaJP-JH 能够在盐胁迫条件下促进小麦幼苗的生长发育,证明该菌株具有一定的应用价值,为微生物菌肥的研发提供依据与菌种资源。且K.indalininaJP-JH 在盐胁迫下对根系分泌的草酸、酒石酸产生影响,为逆境条件下研究微生物与植物互作提供了新的数据。