王孟杰 楼乔明 张 茹 黄 涛 张进杰 杨文鸽

(宁波大学食品与药学学院，宁波 315800)

DHA(docosahexaenoic acid，C22∶6n-3)，又名二十二碳六烯酸，是一种重要的n-3型长链多不饱和脂肪酸，其能有效促进婴幼儿神经系统和智力发育，调节血脂，预防心血管疾病，以及提高免疫力，增强抗炎和抗癌等多种重要生理功能[1，2]。目前，DHA作为重要的新型功能性保健因子，已广泛应用于食品、保健品以及医药等行业[3-5]。

随着功能性油脂行业的发展，DHA的生产方式也已从传统深海鱼油提取转向为微生物发酵生产。裂殖壶菌(Schizochytriumlimacinum)，别名裂壶藻，是真菌门的一类单细胞海洋微生物，被认为是理想的DHA新生资源[6，7]。2010年国家卫生部将裂殖壶菌油脂列为新资源食品，其可替代鱼油，作为功能性油脂用于婴幼儿配方奶粉和多不饱和脂肪酸营养强化剂[8,9]。

目前，裂殖壶菌日益成为国内外学者关注的焦点，并在菌种选育培养和营养方面已有诸多文献报道，但在其脂质成分及抗氧化活性方面却鲜有报道。因此以裂殖壶菌干粉为原料，采用Folch法对其油脂进行提取，并通过气相色谱-质谱和核磁共振技术分别对其脂肪酸组成和脂质成分进行分析，同时对油脂的自由基清除能力和总抗氧化能力进行测定，以期为裂殖壶菌油脂成分分析、营养评价和开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

裂殖壶菌干粉、氘代氯仿(CDCl3，氘代度99.8%+0.03%TMS)、水杨酸、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、TPTZ(三吡啶三吖嗪)和菲啰嗪等。

1.2 仪器与设备

RV-10型旋转蒸发仪， 7890B型气相色谱仪和5977A型质谱仪， AVANCE Ⅲ 400 MHz超导核磁共振谱仪， SpectraMax i3型多功能酶标仪。

1.3 实验方法

1.3.1 油脂提取[10]

采用Folch法对裂殖壶菌干粉油脂进行提取。称取10 g裂殖壶菌干粉，加入200 mL三氯甲烷-甲醇混合液(2∶1)，超声30 min，并浸提24 h；过滤后，滤液用50 mL 0.9%氯化钠溶液振荡洗涤，倒入分液漏斗中静置分层；收集下层三氯甲烷，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩后，得到裂殖壶菌油脂。

1.3.2 脂肪酸分析

甲酯化衍生：取10 mg油脂，加入1 mL 5% H2SO4-CH3OH溶液，70 ℃水浴1 h；反应结束后冷却至室温，依次加入1 mL正己烷和0.5 mL蒸馏水，振荡混匀后静置分层，取上清液，经无水硫酸钠干燥，用于GC-MS分析。

色谱条件：HP-INNOWax毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度250 ℃，检测器温度250 ℃；升温程序：初始温度140 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升至210 ℃，保持15 min；进样量1.0 μL，分流比20∶1；以氦气为载气，载气流量1 mL/min，溶剂延迟时间3 min。

质谱条件：GC-MS接口温度250 ℃，EI离子源，离子源温度230 ℃，电离能量70 eV，质量扫描范围：m/z50～500 u。

1.3.3 核磁共振分析

取50 mg裂殖壶菌油脂，用0.6 mL氘代氯仿溶解，并转移至核磁管中用于核磁共振分析。采用标准的一维氢谱脉冲程序采集氢谱，氢去耦的碳谱脉冲程序采集碳谱。氢谱采集参数：探针温度293.4 K，光谱仪频率400.13 MHz，扫描次数16，空扫次数2，采集点数65 536，氢谱宽度8 012.82 Hz。碳谱采集参数：探针温度294.0 K，光谱仪频率100.62 MHz，扫描次数50，空扫次数4，采集点数65 536，碳谱宽度24 038.46 Hz。

1.3.4 抗氧化能力测定

裂殖壶菌油脂经无水乙醇超声溶解，依次配制成质量浓度为10、20、30、40、50 mg/mL的溶液。DPPH自由基清除能力参照杨娜等[11]方法测定，羟基自由基清除能力参照李巨秀等[12]方法测定，ABTS+自由基清除能力参照杨皓彬等[13]方法测定，总抗氧化能力(FRAP法)参照Ting等[14]方法测定，并以维生素C为对照。

1.4 数据分析

除气相色谱-质谱和核磁共振外，其他各项指标均平行测定3次；通过SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，采用单因素方差分析法(ANOVE)进行显著性检验，并采用Duncan法进行单因素多重比较分析，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 脂肪酸分析

裂殖壶菌油脂经甲酯化衍生后，采用GC-MS对其脂肪酸进行分析，其总离子流色谱图见图1，其脂肪酸分析鉴定结果列于表1。从表1可知，裂殖壶菌油脂脂肪酸组成简单，以C14∶0(13.22%)、C16∶0(26.78%)、C22∶5n-6(DPA，13.66%)和C22:6n-3(DHA，42.04%)为主，且多不饱和脂肪酸含量(PUFA，58.94%)远高于饱和脂肪酸(SFA，41.06 %)。C22∶6n-3，俗称“脑黄金”，是目前已知的碳链最长的n-3型多不饱和脂肪酸，在婴幼儿视网膜形成、神经发育和智力提高等方面起着关键作用；同时其亦具有调节血脂、预防心脑血管疾病、提高免疫活力以及参与炎症反应、增强抗炎和抗癌能力等多种生理功能[15，16]。裂殖壶菌油脂富含C22∶6n-3，脂肪酸组成简单，且与C22∶6n-3具有拮抗作用的结构类似脂肪酸C20∶5n-3含量较低(1.81%)，便于C22∶6n-3的工业化分离制备，因此裂殖壶菌油脂具有很高的营养价值，在食品和医药等领域，尤其是婴幼儿食品方面的具有巨大开发潜力。

图1 裂殖壶菌油脂脂肪酸组成的总离子流色谱图

表1 裂殖壶菌油脂的脂肪酸组成

2.2 核磁共振分析

2.2.1 氢谱分析

裂殖壶菌油脂的核磁共振氢谱(1H-NMR)如图2所示，其谱峰归属列于表2。从核磁共振氢谱可以区分来自饱和脂肪酸(SFA)和多不饱和脂肪酸(PUFA)的信号，且氢谱的谱峰积分与浓度直接成正比，可用以分析不同脂肪酸的比例[17]。从核磁共振氢谱可见，0.85～0.89谱峰为除n-3型多不饱和脂肪酸之外的其他脂肪酸末端甲基上的氢，0.95～0.98为n-3型多不饱和脂肪酸末端甲基上的氢，两者谱峰积分比可计算出n-3型多不饱和脂肪酸酸的含量。2.28～2.35和2.37～2.43谱峰分别归属为饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸(C22∶6n-3和C22∶5n-6)2位上的氢；2.76～2.88谱峰为多不饱和脂肪酸双键间亚甲基上的氢；4.13～4.17和4.28～4.32谱峰为甘油骨架中亚甲基上的氢；5.26～5.29谱峰为甘油骨架中次甲基上的氢；5.31～5.40谱峰归属为所有不饱和脂肪酸碳碳双键上的氢。同时，从核磁共振氢谱中未见磷脂酰胆碱(PC)中与氮原子相连的甲基((CH3)3N—)上的氢(3.33)，以及磷脂酰乙醇胺(PE)中与氮原子相连的亚甲基(—CH2N)上的氢(3.79)[18]。从核磁共振氢谱可知裂殖壶菌油脂富含n-3型多不饱和脂肪酸，且油脂以甘油三酯为主，不含磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺等磷脂成分。

图2 裂殖壶菌油脂的核磁共振氢谱图

表2 裂殖壶菌油脂的核磁共振氢谱谱峰归属

2.2.2 碳谱分析

裂殖壶菌油脂的核磁共振碳谱(13C-NMR)如图3所示，其谱峰归属列于表3。碳谱分辨率高，谱峰重叠程度低，致使裂殖壶菌油脂的核磁共振碳谱比氢谱出峰多且复杂[19]。从核磁共振碳谱中可观察到5个谱区：甲基谱区(11～15)、亚甲基谱区(20～40)、甘油谱区(50～75)、烯烃谱区(121～141)和羰基谱区(172～180)[18，20]。

图3 裂殖壶菌油脂的核磁共振碳谱图

表3 裂殖壶菌油脂的核磁共振碳谱谱峰归属

续表3

在甲基谱区(11～15)，n-6型多不饱和脂肪酸(主要为C22∶5n-6)、饱和脂肪酸(主要为C16∶0和C14∶0)以及n-3型多不饱和脂肪酸(主要为C22∶6n-3) 中甲基谱峰的化学位移分别14.08、14.12和14.27，谱峰区分明确；同时通过谱峰积分比较，可直接证明裂殖壶菌油脂中的二十二碳五烯酸(DPA)为n-6型多不饱和脂肪酸(C22∶5n-6)，而非n-3型多不饱和脂肪酸(C22∶5n-3)，这与气相色谱-质谱定性结果一致，亦与Zhu和Ashford等学者的脂肪酸定性分析结果一致[21，22]。在甘油谱区(50～75)，61.99～62.16和68.88～69.00分别归属为甘油三酯中甘油骨架上sn-1,3和sn-2位碳原子。在羰基谱区(172～178)，172.04谱峰归属为结合于甘油三酯sn-2位上C22∶6n-3和C22∶5n-6的羰基碳原子，172.42谱峰归属为结合于甘油三酯sn-1,3位上C22∶6n-3和C22∶5n-6的羰基碳原子；172.75～172.95谱峰归属为除C22∶6n-3和C22∶5n-6外所有结合于甘油三酯sn-2位上脂肪酸的羰基碳原子，173.14谱峰归属为除C22∶6n-3和C22∶5n-6外所有结合于甘油三酯sn-1,3位上脂肪酸的羰基碳原子，而178.57谱峰归属为游离脂肪酸的羰基碳原子，因此可根据碳谱中羰基碳原子的化学位移快速鉴定甘油骨架上sn-1,3位和sn-2位上结合的脂肪酸类型[17]。从核磁共振碳谱可知裂殖壶菌油脂以甘油三酯为主，含有少量的游离脂肪酸；且C22∶6n-3和C22∶5n-6等多不饱和脂肪酸主要结合于甘油三酯的sn-2位，这与齐冬梅等[5]采用超高效液相色谱-质谱技术所得的C22∶6n-3和C22∶5n-6分布趋势一致。

2.3 自由基清除能力

自由基易与细胞膜磷脂中多不饱和脂肪酸的碳碳双键发生反应造成细胞膜破坏，并进而引发细胞内DNA的氧化损伤，是加速人体衰老和诱发某些疾病的重要原因之一[23]。裂殖壶菌油脂对DPPH自由基、ABTS+自由基和羟基自由基(·OH)的清除能力见图4。从图4可知，裂殖壶菌油脂质量浓度在10～50 mg/mL范围内，其对DPPH自由基、ABTS+自由基和羟基自由基均具有一定清除能力，且随着质量浓度的增加，自由基清除率显著增加(P<0.05)，并呈现典型的量效关系；当裂殖壶菌油脂质量浓度为50 mg/mL时，对三种自由基的清除率分别达到77.81%、67.44%、56.19%；同时通过拟合计算得到裂殖壶菌油脂对DPPH自由基、ABTS+自由基和羟基自由基的半清除率(IC50值)分别为32.16、36.21、40.58 mg/mL，均高于维生素C，表明裂殖壶菌油脂具有较好的自由基清除能力，但清除能力均弱于维生素C。

图4 裂殖壶菌油脂的自由基清除率

2.4 总抗氧化能力

FRAP法是抗氧化物在酸性条件下还原Fe3+-TPTZ产生蓝紫色Fe2+-TPTZ，通常抗氧化物对Fe3+-TPTZ的还原能力与抗氧化能力成正相关，在593 nm处测定Fe2+-TPTZ即可获得抗氧化物的总抗氧化能力[24，25]。FRAP法作为总抗氧化能力的评价指标已广泛应用于食品和保健品的抗氧化能力分析。总抗氧化能力测定标准曲线，如图5所示。由图5可知，在0～0.6 mmol/L范围内，FeSO4浓度与其在593 nm处吸光值成良好线性关系。标准曲线方程：y=1.827 7x-0.018 9(R2=0.997 6)，表明以593 nm处吸光值换算成裂殖壶菌油脂的FeSO4当量浓度的方法是可行的[13]。

裂殖壶菌油脂的总抗氧化能力结果如图6所示。由图6可知，裂殖壶菌油脂具有一定的抗氧化能力，且随着质量浓度的增加，其总抗氧化能力显著增加(P<0.05)，且增加趋势呈线性关系，线性回归方程：y=0.011 9x-0.032 3(R2=0.991 6)，表明方程的拟合度较好。当裂殖壶菌油脂的质量浓度为50 mg/mL时，其总抗氧化能力达到0.57 mmol/L，但远低于维生素C，表明裂殖壶菌油脂具有较好的总抗氧化能力，且呈显著量效关系，但弱于同等质量浓度的维生素C。

图5 总抗氧化测定标准曲线

图6 裂殖壶菌油脂的总抗氧化能力

3 结论

裂殖壶菌油脂的脂肪酸以C14∶0(13.22%)、C16∶0(26.78%)、C22∶5n-6(13.66)和C22∶6n-3(42.04%)为主；其油脂成分以甘油三酯为主，含有少量游离脂肪酸，但不含磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱等磷脂成分，且C22∶6n-3和C22∶5n-6等多不饱和脂肪酸主要结合于甘油三酯的sn-2位。同时，裂殖壶菌油脂具有较好的DPPH自由基、ABTS+自由基和羟基自由基的清除能力和总抗氧化能力，且在10～50 mg/mL范围内呈现显著的量效关系(P<0.05)。裂殖壶菌油脂富含C22∶6n-3以及较好的抗氧化能力，表明裂殖壶菌油脂具有较高的营养价值和脂质开发潜力，可作为C22∶6n-3的重要生物来源，在食品和医药等领域具有巨大应用潜力。