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韭菜迟眼蕈蚊雌雄成虫差异基因表达的转录组分析

2021-11-12胡静荣史彩华

长江大学学报(自科版) 2021年5期
关键词:雌雄差异基因成虫

胡静荣,史彩华

长江大学农学院,湖北 荆州 434025

韭菜迟眼蕈蚊(BradysiacellarumFrey)俗称韭蛆,隶属双翅目眼蕈蚊科[1]。该虫是我国蔬菜作物的重要地下害虫,其寄主范围广,可为害大蒜、大葱、甘蓝、萝卜、甜瓜、芹菜等7科30多种蔬菜、瓜果和食用菌,尤其喜欢取食百合科的韭菜(AlliumtuberosumRottlerexSpreng)[2,3]。在无任何防治措施的情况下,可造成韭菜减产50%左右,严重时毁种绝收[4]。

防治韭菜迟眼蕈蚊的方法有臭氧水、昆虫病原线虫、粘虫板、防虫网和生物菌剂等[5-8]。然而,这些方法均存在一定的局限性,如防治效果差、成本高、操作复杂等。因此,韭菜迟眼蕈蚊仍然是我国韭菜种植业的重大生物灾害。目前,防治韭菜迟眼蕈蚊的首选方法仍然是浇灌化学农药,然而农药的过度使用存在抗药性、食品污染和环境污染等风险[9]。为有效防治韭菜迟眼蕈蚊,研究新的、可持续性的防控措施势在必行。

研究表明,将雌蚊转化为雄蚊是当前蚊虫防控工作的重要突破口。然而,通过生物技术调控昆虫性别必须建立在昆虫性别决定与性别分化的基础之上。目前,为揭示蚊虫的性别差异,KOUTSOS等[10]研究了冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)在胚胎、5个龄期的幼虫、蛹、成蚊等8个连续生命周期中的基因表达谱,结果表明其雌蚊表达量较高的基因主要与免疫有关,雄蚊表达量较高的基因主要与代谢过程有关。WHITTLE等[11]研究表明,埃及伊蚊(Aedesaegypti)卵巢高表达的基因有2927个,精巢高表达的基因有2013个。然而,关于韭菜迟眼蕈蚊雌雄差异表达基因并不清楚。为明确韭菜迟眼蕈蚊雌雄个体在生殖中的作用与贡献,笔者采用PacBio Sequel平台进行第三代转录组测序,从基因水平比较雌雄成虫之间的差异,以期为揭示韭菜迟眼蕈蚊性别决定与性别分化的分子机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

韭菜迟眼蕈蚊由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供,并在长江大学农学院实验室恒温饲养3代,设置温度(25 ± 1)℃、湿度(70 ± 5)%、光照14h∶10h(昼∶夜)。用吸虫管分别将未交配的雌雄成虫收集到不同的1.5mL无菌离心管中,作好标记,放液氮中彻底冷冻、备用。

RNA提取试剂Trizol购置于Invitrogen公司(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA);cDNA文库构建试剂盒购置于Illumina公司(TruseqTM RNA Sample prep Kit);PCR产物纯化试剂盒购置于Qiagen公司(Qiagen, CA, USA);cDNA合成试剂盒购置于Thermo公司(Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit);dNTP购置于TIANGEN。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取、测序、数据校正

将样品送北京诺禾致源科技股份有限公司测序,采用Trizol法提取韭菜迟眼蕈蚊雌雄成虫的总RNA。用带有Oligo(dT)的磁珠,通过A-T互补配对的方法与mRNA的ployA结合富集mRNA,再加入fragmentation buffer打断mRNA,然后用六碱基随机引物(random hexamers)合成cDNA,再加dNTPs、DNA polymerase I合成双链cDNA,并纯化。

将纯化后的双链cDNA进行末端修复,加A尾和测序接头,用AMPure XP beads进行片段大小选择,最后采用PCR富集得到最终的cDNA文库。对检测合格的文库进行上机测序。

用PacBio软件处理测序后的原始数据获得Subreads序列,再通过CCS (Circular Consensus Sequence) 算法进行校正,获得环形一致的CCS序列。将CCS序列分为全长序列(FLNC)与非全长序列(nFL),再将同一转录本的FLNC序列进行hierarchical n*log(n)算法聚类,获得cluster consensus序列。然后对全长序列进行polish,获得高质量的Polished consensus序列,用二代转录组数据校正Polished consensus序列,并用CD-HIT软件去冗余,得到非冗余转录本,包括CDS序列和unigene序列的数量。

1.2.2 基因功能注释

分别用NCBI blast、Blast2GO和KAAS软件,将1.2.1中拼接得到的unigenes序列与Nr非冗余蛋白质序列数据库、Nt核酸序列数据库、KOG同源蛋白簇数据库、GO 基因本体论数据库,以及KEGG日本京都基因和基因组百科全书数据库(e-value<0.00001)进行比对,获得All Unigene 在每个数据库中的功能注释信息。

1.2.3 基因表达差异分析

按照基因的表达量(FPKM值)计算基因在韭菜迟眼蕈蚊雌雄样本间的差异表达倍数,并结合差异检验的FDR(false discovery rate)值筛选雌雄样本间的差异表达基因。

1.2.4 基因差异富集分析

用KEGG注释信息得到Unigene基因的pathway注释,选择q-value≤0.05的pathway为差异表达基因中的显著富集条目。

2 结果与分析

2.1 韭菜迟眼蕈蚊雌雄成虫基因功能注释

2.1.1 Nr数据库注释

将韭菜迟眼蕈蚊雌雄成虫基因序列与Nr数据库进行比对,结果表明,雌成虫注释到11950个基因,对应312个物种;雄成虫注释到16571个基因,对应353个物种。同时,分别对雌雄成虫注释到的物种按基因相似度进行排序,取相似度排前20位的物种作图,其中,雌雄成虫共有的高相似物种占95%,详见图1。

图1 韭菜迟眼蕈蚊雌雄成虫基因序列与Nr数据库物种比对的注释信息Fig.1 Annotation information on gene sequences of male and female adults of Bradysia cellarum compared with species in Nr database

图2 韭菜迟眼蕈蚊雌雄成虫的GO分类 Fig.2 GO taxonomy of male and female adults of Bradysia cellarum

2.1.2 GO分类

将韭菜迟眼蕈蚊雌雄成虫基因序列进行GO注释,结果表明,雌虫注释上的基因数为9705个,雄虫注释上的基因数为12168个。将基因功能按照细胞组分、分子功能和生物学过程进行分类,雌虫分别占11114、11910、19600个,雄虫分别占13473、14394、25332个,详见图2。

2.1.3 KOG分类

将韭菜迟眼蕈蚊雌雄成虫基因序列与KOG数据库进行比对分类,结果表明,雌虫比对上10781个基因,雄虫比对上14520个基因,详见图3。

图3 韭菜迟眼蕈蚊雌雄成虫的KOG分类图Fig.3 KOG taxonomic map of male and female adults of Bradysia cellarum

2.1.4 KEGG分类

图4 韭菜迟眼蕈蚊雌雄成虫基因功能注释KEGG代谢通路分类Fig.4 Classification of gene function annotation to KEGG metabolic pathways in male and female adults of Bradysia cellarum

将韭菜迟眼蕈蚊雌雄成虫基因序列与KEGG数据库进行比对,结果表明,从雌雄成虫转录组数据中分别获得13064和23488个转录本。对雌雄成虫的基因分别按6大通路进行注释,结果表明,雌虫中参与细胞过程(cellular processes)、环境信息处理(environment information processing)、遗传信息处理(genetic information processing)、人类疾病(human disease)、新陈代谢(metabolism)和机体系统(organismal systems)的基因通路分别为1560、1237、1363、2643、1701、2160条;雄虫中参与细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、新陈代谢和机体系统的基因通路分别为228、2055、1276、4132、3301、3865条,详见图4。

2.1.5 数据库之间的维恩图分析

韭菜迟眼蕈蚊雌成虫注释到Nr、Nt、KOG、KEGG、GO等5个数据库中的基因分别为11950、4091、9562、10012、9704条,其中共同注释到的基因有3209条,详见图5(a)。雄成虫注释到Nr、Nt、KOG、KEGG、GO等5个数据库中的基因分别为16571、6046、12873、16203、12168条,其中共同注释到的基因有4402条,详见图5(b)。

2.2 差异基因表达分析

2.2.1 韭菜迟眼蕈蚊雌雄成虫差异基因筛选

根据韭菜迟眼蕈蚊雌雄成虫基因表达倍数比表明,上调的基因有9794个,下调的基因有8881个,无显著差异的基因有5472个,详见图6。

2.2.2 韭菜迟眼蕈蚊雌雄成虫差异基因维恩图

雄性成虫特有基因6833个,雌性成虫特有基因3898个,雌雄成虫共同拥有的基因17763个,详见图7。

2.3 韭菜迟眼蕈蚊雌雄成虫差异基因KEGG富集分析

对雌雄成虫的差异基因进行KEGG富集,结果表明,上调基因的富集通路282个,平均q-value为0.00088;下调基因的富集通路285个,平均q-value为0.0048。挑选富集最显著的20条pathway作图,其中包含上调基因1821个,下调基因1351个。差异表达基因明显富集在有机酸代谢、肽代谢过程等功能类别上,参与核糖体生物合成、RNA转运等,详见图8。

注:横坐标代表基因在雌雄成虫样品中表达倍数,纵坐标代表基因表达量在统计学上的显著程度。其中,校正后的p-value越小,-log10越大,即差异越显著。图中散点代表各个基因,蓝色圆点表示无显著差异的基因,红色圆点表示显著上调的基因,绿色圆点表示显著下调的基因。图6 韭菜迟眼蕈蚊雌雄基因差异表达分析Fig.6 Differential expression analysis of male and female genes of Bradysia cellarum

注:每个大圆中数字的和代表某种样品差异基因总数,圆圈交叠处的数字表示雌雄成虫共有的差异基因。图7 韭菜迟眼蕈蚊雌雄成虫差异基因维恩图Fig.7 Venn map of differential genes of male and female adults of Bradysia cellarum

3 讨论与结论

转录组通常指物种或组织中所有 RNA 转录产物的集合[12]。不同物种或同一物种的不同组织或同一组织的不同时期,它们的转录组表达情况均存在很大差异[13]。分析生物雌雄样本的转录组数据,有利于挖掘系统发育基因、性别关联基因、特异遗传性状基因等[14]。

注:纵轴表示pathway名称,横轴表示pathway对应的富集因子。qvalue值越小则颜色越接近红色,每个pathway下包含的差异基因的多少用点的大小来表示。图8 韭菜迟眼蕈蚊雌雄成虫差异基因KEGG富集散点图Fig.8 Scatter plot of differential gene KEGG enrichment of male and female adults of Bradysia cellarum

该研究分别构建了韭菜迟眼蕈蚊雌雄成虫的2个cDNA文库。其中,在雌性cDNA文库中获得13064条unigenes,同时被Nr、Nt、KOG、KEGG和GO等数据库注释的基因有3209条;在雄性cDNA文库中获得23488条unigenes,同时被Nr、Nt、KOG、KEGG和GO等数据库注释的基因有4402条。雄性成虫高表达的基因数显著多于雌性成虫,可能与雄性成虫活动能力略强于雌性成虫有关[15]。

韭菜迟眼蕈蚊雌雄成虫表现出高度的性别二态性,比如雌性个体大,雄性个体小;雌虫腹部粗大,末端细而尖,雄虫有1对抱握器等[16]。转录组数据分析有助于阐明性别二态性的分子机理,对揭示性别分化和性别决定具有重要意义。研究结果表明,韭菜迟眼蕈蚊偏向雄性的基因多于雌性,其中雄性特有的基因6833条,雌性特有的基因3898条,与EADS等[17]研究水蚤的结果一致。然而,赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)[18]、冈比亚蚊[19]和埃及伊蚊[11]的特有基因数量偏向雌性,从而暗示物种不同,性别基因的偏向并不相同。KOUTSOS等[10]研究表明,冈比亚按蚊雌蚊的高表达基因主要与免疫有关,雄蚊高表达基因主要与代谢有关。韭菜迟眼蕈蚊的高表达基因之所以偏向雄性,可能与雄性超强的交配能力和强于雌性的飞行能力需要超强的代谢功能有关[20],但具体原因有待进一步研究。

转录组序列的拼接算法包括有参考基因组序列的拼接方法和无参考基因组序列的拼接方法:参考基因组序列的拼接算法主要有Cufflinks[21]和Scripture[22]等开发软件;无参考基因组序列的拼接算法主要有ABySS[23]、SOAP denovo[24]、Trinity[25]等开发软件。笗者利用新一代高通量测序技术对韭菜迟眼蕈蚊雌雄成虫进行转录组测序,再采用无参考基因组序列的拼接算法对韭菜迟眼蕈蚊序列进行拼接,与序列表达标签(EST)技术进行比较,具有测序数据覆盖度高的优点。该研究为揭示韭菜迟眼蕈蚊性别决定、生殖生长、营养代谢等分子机制奠定了基础,同时,丰富了昆虫遗传信息库,有助于韭菜迟眼蕈蚊绿色防控新技术研发。

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