李 艳，白 杨，魏 丹,2*，王 伟，李玉梅，薛 红，胡 钰，蔡姗姗

1.东北农业大学资源与环境学院，黑龙江 哈尔滨 150030 2.北京市农林科学院植物营养与资源环境研究所，北京 100097 3.黑龙江省农业科学院土壤肥料与环境资源研究所，黑龙江 哈尔滨 150086 4.黑龙江省农业科学院克山分院，黑龙江 齐齐哈尔 161000 5.沈阳农业大学土地与环境学院，辽宁 沈阳 110866

引 言

随着绿色农业的发展，有机无机肥配合施用是提高土壤肥力、有效利用资源、保持作物高产稳产最有效的施肥方式[1]。黑龙江省作为我国主要的粮食产地，2019年秸秆产生量已达到1.3亿吨左右[1]，关注农作物产量的同时，秸秆资源如何被高效利用已成为社会热点。当前，秸秆作为原料生产有机肥对实现农田资源合理利用、秸秆有效还田具有重要意义。

腐殖质是土壤有机质中重要的组成成分，根据其在酸性碱性溶液中的溶解度差异，分为富里酸(FA)、胡敏酸(HA)和胡敏素(HM)，其中FA是腐殖质组分的中间产物，是形成HA的一级物质，也是HA的分解产物，FA对促进矿物分解和养分释放具有重要作用[2]。

目前，研究学者多通过土壤理化特性分析有机质提升效果来探讨有机无机肥配施的最佳比例[1]。随着现代仪器分析方法的发展，光谱技术(红外光谱法、紫外光谱法、荧光光谱法等)能从物质的分子质量、芳构化程度以及分子聚合度等不同角度评估有机质的腐殖化程度[3-4]。当前采用光谱技术对土壤有机碳及组分从物质结构的角度进行了大量报道，并对土壤HA和FA在有机无机肥配施条件下有机化合物组成及分子结构变化进行了分析[5-6]。

不同比例有机无机肥配施，尤其是秸秆有机肥进行合理的无机肥替代后，对土壤FA荧光特性变化的研究较少，合理可行的有机无机肥配施是土壤有机质提升和秸秆资源利用的关键。本试验在黑龙江省齐齐哈尔市黑土区进行，秸秆有机肥进行不同比例的无机肥替代，分析土壤有机碳(soil organic carbon, SOC)及FA含量，通过三维荧光光谱技术结合平行因子分析法对不同处理土壤FA荧光特性进行分析，探讨不同比例有机无机肥配施条件对土壤FA荧光组成和结构的影响，以期提出合理的有机无机肥配施比例建议，为黑龙江省黑土有机质提升和秸秆资源利用提供科学依据。

1 实验部分

1.1 试验地概况及设置

试验区位于克山县(黑龙江省齐齐哈尔市，E126°01′，N47°43′)试验农田，种植作物为玉米。寒温带大陆季风气候，有效积温2 400 ℃，年均气温2.4 ℃，年均降雨量502.5 mm，无霜期120 d，作物生长期约120 d。土壤类型为黑土，基本化学性质如表1所示。

表1 土壤基本化学性质

试验采用秸秆有机肥替代无机肥，设置不施肥(CK)、单施无机肥(NPK)、有机肥替代无机氮肥25%(NPKM1)、有机肥替代无机氮肥50%(NPKM2)、有机肥替代无机氮肥75%(NPKM3)、有机肥替代无机氮肥100%(NPKM4)6个处理，各处理磷肥、钾肥(化肥和有机肥共同含量)用量相同，施肥量氮肥为113 kg·hm-2，磷肥(P2O5)为75 kg·hm-2，钾肥(K2O)为37.5 kg·hm-2。试验小区组成随机排列，共计18个小区，每个小区面积为6 m×4 m，设置3次重复。无机肥分别是尿素、过磷酸钙和硫酸钾。有机肥由畜禽粪污、玉米秸秆按体积比4: 6混合，利用卧式连续生物发酵罐经高温(大于60 ℃)快速腐熟后加工制得，其基本化学性质如表2所示。

表2 有机肥基本化学性质

1.2 土样采集和试验方法

1.2.1 土样采集

试验开始于2018年，2019年9月对各处理小区土壤进行采集，采用S形取样法，深度为0～20 cm。采集样品自然风干后过分样筛(孔径0.25 mm)，常温保存备用。

1.2.2 FA提取与纯化

称取试验样品5.0 g，加入50 mL的NaOH(0.1 mol·L-1)和Na4P2O7(0.1 mol·L-1)1∶1混合溶液(pH 13)，摇匀后水平振荡(180 r·min-1)浸提24 h，取出后离心20min(12 000 r·min-1，4 ℃)，过0.45 μm孔径滤膜，收集上清液即为FA溶液。用6 mol·L-1HCl调节pH值至1.0，室温静置12 h后离心20 min(12 000 r·min-1，4 ℃)，得上清滤液定容至50 mL容量瓶，溶液通过吸附树脂和交换树脂柱，即得到纯化的FA溶液[7-8]。

1.2.3 荧光特性测定

利用multi N/C 2100型TOC分析仪(Analytik Jena AG，德国)测定FA溶液浓度，然后将所有样品的FA浓度调至25 mg·L-1。利用荧光光谱仪(日立F-7000型，日本)测定FA溶液样品三维荧光光谱，参数设置参考文献[6]：激发波长(Ex)扫描范围：200～490 nm，带宽10 nm；发射波长(Em)扫描范围：250～550 nm，带宽5 nm，扫描速度：1 200 nm·min-1。平行因子(PARAFAC)分析时，应消除水离子的散射，消除拉曼散射对荧光数据的影响。

1.3 数据分析

使用Matlab进行PARAFAC分析，绘制三维荧光图谱；利用Origin 2019b软件计算荧光指数(FI)[9]：Ex/Em=370 nm/450 nm，500 nm；生物指数(BIX)[10]：Ex/Em=310 nm/380 nm，420～435 nm和腐殖化指数(HIX)[10]：Ex/Em=254 nm/435～480 nm，300～345 nm。利用Microsoft Excel 2007完成数据计算及图表绘制，利用SPSS 19.0软件进行差异及相关性分析，运用Canoco 4.5软件进行RDA分析。

2 结果与讨论

2.1 土壤有机碳及富里酸含量

如图1所示，有机无机肥配施后提高了SOC和土壤FA含量(p<0.05)。CK处理中SOC含量为14.88 g·kg-1，单施无机肥和有机无机配施各处理较CK处理中SOC含量增加14.14%和7.13%～23.31%。其中NPKM2处理SOC含量为18.35 g·kg-1，比CK处理和NPK处理的SOC含量分别提高23.31%和8.06%。CK处理土壤FA含量为2.51 g·kg-1，单施无机肥和有机无机配施各处理较CK处理中土壤FA含量增加52.59%和18.33%～73.71%。其中NPKM2处理土壤FA含量为4.36 g·kg-1，比CK处理和NPK处理的土壤FA含量分别提高73.71%和13.84%。说明NPKM2处理，即有机肥替代无机氮肥50%对提高SOC和土壤FA含量效果明显。单施无机肥受作物和土壤环境影响会导致养分转化效率低，有机肥养分活性较高，过量施用会造成浪费，所以合理的有机无机肥配施使土壤养分更均衡，适量添加有机肥会增加土壤微生物群落多样性，对养分有效循环利用、提高土壤有机质起到积极作用，与Yang等[1]研究有机无机肥配施可提高农田土壤有机质含量结果一致。

图1 有机无机肥配施后黑土SOC和FA含量差异

2.2 土壤FA荧光光谱指数分析

采用荧光光谱指数FI，BIX和HIX表征不同处理条件下土壤FA的特征，FI可反映腐殖质来源[9]，BIX可衡量自生源有机质所占比例[10]，HIX表征有机质腐殖化程度[10]。

如表3，各处理FI均大于1.4，小于1.9[9]，说明土壤腐殖质中FA来源受自生源和外生源共同作用的影响，既有来自于土壤有机质转化过程中自身产生的FA，亦有有机肥施入土壤后通过微生物分解而新近产生的FA；FI大小依次为：NPKM2>NPKM4>NPKM3>NPKM1>NPK>CK。相比CK处理和NPK处理，有机无机肥配施后，土壤FA受自生源影响更大，其中NPKM2处理中FA受自生源影响最大，FI为1.71±0.03。有机无机肥配施条件下，因有机肥养分含量高、微生物群落丰富，在与土壤中土著微生物共同作用的基础上，加快了土壤腐殖质物质间的转化速度，提高了腐殖化速率。

表3 土壤FA荧光光谱指数

BIX表征处理间土壤FA均呈现出重要的新近自生源特征(0.7NPKM4>NPKM3>NPKM1>NPK>CK，土壤腐殖化是个漫长的过程[10]，因此自生源有机质处理间差异不显著。

HIX表征处理间FA均呈现腐殖质特征和重要的新近自生源(1.5NPKM4>NPKM3>NPKM1>NPK>CK；有机肥的施入显著提高了土壤腐殖化程度(p<0.05)，新近自生源物质可能是由于有机肥施入分解产生新的FA，合理的有机无机肥配施比例，加快了土壤中物质的相互转化[1]；NPKM2处理HIX为2.94±0.41，比CK处理和NPK处理提高44.12%和24.58%，其腐殖化程度最高。

综上所述，FI，BIX和HIX表征处理间差异结果一致，NPKM2处理即有机肥替代无机氮肥50%，土壤微生物代谢能力强，土壤有机质物质间转化率快，土壤腐殖化程度高，增加新生的生物利用物质，对土壤培肥有积极的效果。

2.3 土壤FA荧光组分特征

采用平行因子法分析不同处理条件下土壤FA的三维荧光光谱数据，参考文献[11-13]，得到3种荧光组分，荧光组分的三维荧光光谱分布见图2。

图2 不同处理条件下土壤FA三维荧光组分

组分C1为类富里酸，包含2个激发峰和1个发射峰(Ex/Em=275 nm, 325 nm/410 nm)，分别代表紫外光区类富里酸和可见光区类富里酸，分别对应着传统的A峰(Ex/Em=230～260 nm/370～460 nm)和C峰(Ex/Em=310～360 nm/370～480 nm)，两类物质均属于陆源类腐殖酸，指示外源输入。组分C1峰值位置较传统峰发生红移，说明类富里酸物质相对分子质量大，生物可降解性低，其中A峰荧光强度值高于C峰，这可能与土壤FA分子中存在的羰基和羧基相关[13]，也与外源输入有机肥物质组成有关，通常C1组分可体现肥料的供肥能力，对土壤培肥起到重要作用。

组分C2为类胡敏酸，包含2个激发峰和1个发射峰(Ex/Em=250 nm, 350 nm/460 nm)，代表类胡敏酸，属于腐殖质类物质，对应传统F峰(Ex/Em=250～370 nm/430～530 nm)。张久明等[5]，He和Hur[13]研究结果均显示类胡敏酸分子量较大、芳构化程度高，主要含有一些分子量较大的芳香基团，由于生物直接利用率低，可提高土壤的腐殖化程度。组分C2峰值较传统F峰稍有红移，说明类胡敏酸组分对有机无机肥配施措施提高土壤腐殖质有重要作用。

组分C3为类蛋白质，包含2个激发峰和1个发射峰(Ex/Em=275 nm, 225 nm/340 nm)，均指示类色氨酸，与羧基官能团有关，分别对应指示短波类色氨酸的T峰(Ex/Em=225～230 nm/320～350 nm)和指示长波类色氨酸的T1峰(Ex/Em=275 nm/340 nm)。通常类色氨酸类物质被认为是细菌降解的代谢产物，易与大分子蛋白结合[14]。组分C3较传统峰值发生红移现象，说明有机肥的施入后，加快了土壤中物质的转化，同时微生物的代谢作用增加了酶或生物残体，芳香环氨基酸被游离或分解出来，导致类蛋白质物质含量升高，与谷思玉等[6]研究结果一致。

2.4 荧光强度及RDA分析

土壤FA不同组分的荧光强度及贡献率如表4所示，各组分的Fmax值反映其相对含量，可用来表征土壤FA结构变化情况。随着有机肥替代量的增加，C1和C2组分荧光强度先增强后减弱，C3组分荧光强度逐渐减弱。其中NPKM2处理C1组分Fmax值最高，为(2 127.42±124.08)R.U.，比CK和NPK分别升高28.44%和22.57%；C2组分Fmax值同样最高，为(906.28±94.36)R.U.，比CK处理和NPK处理分别升高32.19%和35.90%；C3组分Fmax值相对其他处理较低，为(535.28±283.05)R.U.。有机无机肥配施处理的土壤FA荧光组分中类富里酸、类胡敏酸和类蛋白物质含量明显增加；其荧光强度值与FA的结构和官能团相关，类富里酸与类胡敏酸物质因芳构化程度较高，含有羟基、氨基、甲氧基等荧光强度较高的基团；类蛋白质物质相对分子量较大，含有羧基、羰基等荧光强度较低的电子基团[15-16]。大分子物质相对含量增加，小分子物质相对含量减少，芳香度的提高对提高土壤腐殖化程度，提升土壤有机质有积极作用。总荧光强度(C1+C2+C3)Fmax值NPKM2>NPK>NPKM1>NPKM3>NPKM4>CK，NPKM2处理的Fmax值最高，为(3 568.98±167.03)R.U.，比CK和NPK分别升高24.37%和1.07%，所以NPKM2处理土壤FA相对含量最高。

表4 土壤FA荧光组分荧光强度及相对百分比

不同处理条件下，C1组分相对百分比NPKM3>NPKM2>NPKM4>NPK>NPKM1>CK，C2组分相对百分比NPKM2>NPKM4>NPK>NPKM1>CK>NPKM3，C3组分相对百分比CK>NPKM1>NPKM3>NPKM4>NPK>NPKM2。从土壤FA荧光组分的组成角度分析，类富里酸、类胡敏酸相对百分比越高，类蛋白质相对百分比越低，FA芳构化程度越高，土壤腐殖化程度也就越高[17-18]。有机无机肥配施显著提高了C1和C2组分百分比(p<0.05)，可在一定程度上提高土壤腐殖化程度，其中NPKM2处理中土壤FA荧光C3组分百分比最低，C1组分相对百分最高，与荧光强度值表征结果一致，说明有机肥替代无机氮肥50%处理可显著提高土壤FA含量。

不同处理条件下Fmax值、SOC、土壤FA进行RDA分析，第一、二排序轴解释总变量的88.0%，如图3所示，各组分Fmax值与第一排序轴成负相关，SOC和土壤FA与第二排序轴成正相关。SOC、土壤FA与不同组分Fmax值均成正相关，Fmax值与SOC、土壤FA相关性大小依次为C1>C2>C3。类富里酸、类胡敏酸组分因芳构化程度高，结构稳定，在SOC和土壤FA组成物质中具有维持有机质稳定性的重要作用[6, 13]。有机无机肥配施条件下，不同处理对SOC、土壤FA及各组分Fmax值影响大小依次为NPKM2>NPKM1>NPK>NPKM3>NPKM4>CK。通过从土壤FA荧光特性角度分析，有机肥替代无机氮肥50%这一施肥比例，增加土壤有机质结构中的大分子物质，使其复杂化，促进土壤环境改善，对提高SOC和土壤FA含量，协调土壤供肥能力具有重要意义。

图3 不同处理条件、荧光强度和土壤碳含量三者的RDA分析

3 结 论

有机无机肥配施提高了SOC和土壤FA含量，其中有机肥替代无机氮肥50%对提高SOC及土壤FA含量效果明显，比CK和NPK的SOC含量分别提高23.31%和8.06%，土壤FA含量分别提高73.71%和13.84%。有机无机肥配施条件下土壤FA受自生源和外生源共同作用的影响，呈现强腐殖质和重要的新近自生源特征，其中有机肥替代无机氮肥50%条件下土壤腐殖化程度最高。不同处理条件下土壤FA包含3种荧光组分：C1组分为类富里酸(紫外光区类FA和可见光区类FA)，C2组分为类胡敏酸，C3组分为类蛋白质(短波类色氨酸和长波类色氨酸)。随有机肥比例升高，NPKM2处理类富里酸和类胡敏酸Fmax值最高，类富里酸的相对百分比最大，对SOC、土壤FA和各组分Fmax值影响最大，秸秆有机肥替代无机氮肥50%的施用比例可作为黑土有机质提升的施肥指导。