武彩霞 马晓茜 唐敏芳 于宗琴 李娅宁 霍连广

匹诺塞林是中国医学科学院药物研究所研制的一种新型脑保护新药,属于黄酮类化合物,蜂胶中含量较高。已有多项研究资料证明,匹诺塞林有抗氧化、抗炎、抗凋亡、血管舒张等多方面药理作用［1-6］,能减轻脑缺血再灌注损伤［7］,但其作用靶点仍然不清楚。为进一步探讨匹诺塞林脑保护的作用机制,为寻找其作用靶点提供启示,本文用缺糖缺氧/复糖复氧损伤SHSY5Y 细胞模拟脑缺血再灌注损伤模型,观察匹诺塞林对细胞内钙离子［Ca2+］i 变化及Caspase-12 表达的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 匹诺塞林冻干粉,批号 201804；SH-SY5Y 细胞株,中国医学科学院基础研究所提供；DMEM/F12 培养基,标准胎牛血清,Gibco 公司产品；胰蛋白酶、Sigma 公司产品；钙离子荧光探针Furo 4-AM,Invitrogin 公司产品；Caspase-12(SC-5627)一抗,美国Santa Cruz Biotechnology 公司产品,Dylight651-conjugated 荧光二抗：美国CST 公司产品。

1.2 主要仪器与设备 细胞孵育箱,日本三洋公司；高内涵细胞成像仪,英国Thermo Fisher 公司；超净纯水仪,美国Beckman 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 SH-SY5Y 细胞培养 SH-SY5Y 细胞在含有10%胎牛血清的DMEM/F12 基质中培养,每2～3 天换液1 次。细胞呈对数增长时,加0.25%胰蛋白酶消化,200 μl/孔(5000 个/孔)接种在96 孔培养板中,培养24 h 后,更换无糖EBSS 平衡盐溶液(154 NaCl,5.6 KCl,5.0 HEPES,3.6 NaHCO3,2.3 CaCl2,pH 7.4；单位mmol/L)［8］,随机分为OGD/R 组及匹诺塞林低剂量组、中剂量组、高剂量组,OGD/R 组不加任何药物；匹诺塞林低剂量组、中剂量组、高剂量组调整终浓度分别为0.01、0.10、1.00 μM。三气培养箱中培养。培养条件：37℃,5%CO2,1%O2,94%N2；培养2 h 后,移除培养液,更换完全培养基,复糖复氧培养。培养条件：37℃,5%CO2,饱和湿度下培养12 h。对照组更换完全培养基,正常条件下培养。……