徐婧祎 安于 陈秀红 何生虎

（宁夏大学 750021）

所谓细胞系(Cell line) 指原代细胞经环境或认为调控后能多次传代的细胞群体。本实验鸡成纤维细胞永生化后获得的就是能稳定传代并没有杂细胞的系统。稳定细胞系构建是将外源质粒整合到目的细胞染色体上的一个过程，这一过程使得宿主细胞能长期并且稳定的表达蛋白[1-5]。慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体[6]。与传统意义的逆转录病毒载体相比，其对感染能力更强。本实验通过逆转入病毒，慢病毒感染，筛选稳定细胞株这一方式达到细胞永生化的目的。

1 材料和方法

1.1 材料

电热恒温震荡水槽（上海精宏实验设备有限公司）；T25 细胞培养瓶（Corning）血球计数板、24 孔板专用细胞玻片、细胞培养孔板（Solarbio）；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）（Gibco）；多聚甲醛（PFA）、DAPI、Triton X-100、山羊血清（Solarbio）；CoraLite594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)（Proteintech）、SV40 过表达慢病毒（汉尹生物）。

1.2 方法

1.2.1 鸡胚成纤维细胞的分离培养

取10 日龄左右鸡胚，用75%酒精消毒蛋壳，从气室端用镊子小心取出鸡胚，置于培养皿中，用眼科剪小心除去头、四肢和内脏部分，剩余胚体用PBS 清洗3 次，将洗净的胚体剪碎，并反复清洗3 次，收集剪碎的胚体，加入0.25% Trypsin 37℃水浴震荡消化30～40min，将消化液过100μm 滤网，收集滤液，300g 离心5min，弃上清，重悬沉淀，铺瓶。

1.2.2 免疫荧光鉴定

细胞玻片；固定；破膜封闭；一抗孵育，（抗体：PBS 为1:100），破膜封闭后，取50uL 一抗于防水膜上（湿盒中），盖玻片后4℃恒温加（最多可放置一周）二抗，室温避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h 后，PBS 洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS 洗3×5min/次；包埋，玻片上各滴1 滴Fluoromount-G，将有细胞的一面盖上。

1.2.3 鸡胚成纤维细胞的转染

1.2.3.1 过表达慢病毒选择

本实验选用的慢病毒载体元件信息为EF1α-SV40-IRES-puromycin，GFP 为荧光标记基因，Puromycin 抗性基因标记。

1.2.3.2 转染

将鸡胚成纤维细胞接种6 孔板，每孔细胞数约为1×105个；24h 后细胞贴壁，换液；加入1ml 完全培养基，再加20μL SV40 过表达慢病毒；12h 后观察细胞状态，并更换为新鲜培养基；观察细胞贴壁超80%，分瓶至T25 培养瓶中。转染后细胞扩增3～4 代后进行筛选。

1.2.4 鸡胚成纤维细胞的筛选

1.2.4.1 杀灭曲线

未处理的鸡胚成纤维细胞按每孔0.05million 铺入24 孔板，孵育过夜；第2 天，弃掉废液；将含不同浓度嘌呤霉素（1、2、3、4、5、6、7ug/ml）的新鲜培养基加入已铺有细胞的24孔板；每2d 换筛选培养基一次；每天观察细胞的变化；最小的嘌呤霉素使用浓度是从嘌呤霉素筛选开始1～4d 内杀死所有细胞的最低筛选浓度。

1.2.4.2 嘌呤霉素筛选转染细胞

首日，将转染的鸡胚成纤维细胞按每孔0.05million 加至24孔板，孵育过夜；24h 后除去板中废液；加入含嘌呤霉素（1ug/ml）的筛选培养基，孵育，对筛选后的细胞进行扩增。

1.2.5 鸡胚成纤维细胞的扩增

倒出废液，加入无菌pbs 洗液（5～8ml）轻轻润湿细胞，之后吸走洗液；向瓶内加入含0.25%EDTA 的胰蛋白酶混合液少许，以能覆满瓶底为限；置温箱中2～5min，终止消化；加入该细胞对应的培养基6ml 终止消化，形成细胞悬液。依据传代比例，将细胞悬液分瓶，再补充培养基后，静置于温箱培养，直至贴壁。

2 结果

2.1 原代细胞收集

原代细胞分离后，细胞分布均匀但仍有少量杂细胞分布，细胞活性良好。

2.2 免疫荧光鉴定

通过DAPI 染色，细胞核结构正常，荧光显微镜下观察有蓝色荧光，用Fluoromount-G 封片剂后封片，可以清晰看到细胞分布均匀且间距匀称，荧光反应明显，见图1。

图1 DAPI 染色及封片荧光图

2.3 转染结果

用慢病毒包装转染鸡胚胎成纤维细胞，24h 后实验细胞被接种在灭活饲养层，在转染5d 后出现明显的菌落细胞，表现出典型的干细胞大核和核仁显著等特点。稳定重编程细胞培养在无饲养层的培养皿中，获得的细胞在人工基膜上传代超过50代次，表明这些细胞获得永生性特征，见图2。

图2 慢病毒转染后细胞显微镜结构

2.4 杀灭浓度及嘌呤霉素筛选转染细胞

通过未转染的鸡胚成纤维细胞与不同浓度嘌呤霉素（1、2、3、4、5、6、7ug/ml）作用后，可见嘌呤霉素筛选开始1～4d 内杀死所有细胞的最低筛选浓度，确定使用浓度为1ug/ml，作用时间为2d。

将上一步得到的结果用于已转染的鸡胚成纤维细胞，作用2d 后通过显微镜可见白色亮点为已死细胞，贴壁细胞即为转染成功后的鸡胚成纤维细胞。

2.5 鸡胚成纤维细胞永生化后扩增

将上一步得到的已转染的鸡胚成纤维细胞通过胰酶消化法进一步扩增，扩增到12 代时，通过显微镜观察得到如下图片所示结果，可见细胞数量多，分布均匀，体态完整，形态正常，为纺锤形或星型，贴壁，见图3。

图3 初代永生化细胞

3 讨论

目前，国内外关于鸡胚成纤维细胞原代培养的方法比较常见，传代稳定的鸡胚成纤维细胞系常用的是商品株DF-1，但鸡胚成纤维细胞通过永生化而转化成稳定传代细胞系的报道比较少见。

本实验中通过慢病毒感染进一步获得需要细胞。病毒转染细胞的过程包括病毒与目的细胞吸附、病毒变形内化、入胞、细胞内再定位、病毒脱衣壳、入核、复制及包装[7]，本实验中用于细胞改造的慢病毒毒性基因已被剔除属于假型病毒[8]，感染目的细胞后不会再感染其他细胞，并且不会在宿主细胞内复制，具有低毒性，在实验过程中也不会发生特异性反应[9-11]。实验结果通过一系列验证，目的细胞永生化，通过这一试验为以后其他种类的纤维细胞永生化提供一定的基础。