段 玉，马志敏，许建建，宾 羽，宋 震，周常勇

(西南大学柑桔研究所/中国农业科学院柑桔研究所，重庆，400712)

柑桔黄龙病(Citrus Huanglongbing，HLB)最先由泽田兼吉[1]报道在我国台北发生，1919年Reinking[2]报道该病在我国广东潮州亦有发生，迄今已有百余年发生史。柑桔黄龙病病原为韧皮部杆菌，属革兰氏阴性细菌(CandidatusLiberibacter)[3]，在田间自然传播主要通过媒介——亚洲柑桔木虱(DiaphorinacitriKuwayama)[4]进行，能为害几乎所有的柑桔种类。柑桔黄龙病的病原目前仍不能分离纯培养，植株染病后也无有效治疗药剂，其有效防控手段为及时清除病树、种植无病苗木和集中大面积防治传播媒介[5]。因此，通过建立快速简便的黄龙病菌检测方法，实现黄龙病的早发现、早诊断，对该病的防控具有重要意义。

针对柑桔黄龙病菌，研究人员已建立了多种分子检测方法，如利用黄龙病菌16 S rRNA、β-操纵子(rplKAJL-rpoBC)和外膜蛋白(omp)基因等保守基因序列设计特异性引物建立了聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)[6]、Nested-PCR[7]、实时荧光PCR[8]、数字PCR[9]等检测方法。这些检测方法除对仪器要求高和耗时长外，对操作者也有一定的技术要求。环介导等温扩增法(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)突破了仪器障碍[10]，但探针和6对引物的设计较复杂。近年来，一种新型的等温核酸扩增技术——重组酶聚合酶恒温扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，因具备快速、灵敏、操作简便的特点而受到关注，并且已经广泛应用于动植物的病害检测，如产单核细胞李氏杆菌的RPA-LF[11]、小肠结膜炎耶尔森氏菌的实时荧光RPA[12]。

柑桔黄龙病菌的RPA荧光检测技术也已建立[13]，其在对柑桔核酸进行粗提取后，运用重组聚合酶对目的基因片段进行恒温快速扩增，加入稀释后的荧光试剂在15 min内完成可视化检测。……