陈 晗，张 争，陈向东，王 勇，王琦宏 ，曾念开▲

(1中国医学科学院&北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193；2教育部热带转化医学重点实验室-海南省热带药用植物研究开发重点实验室-海南医学院药学院，海南 海口 571199；3白沙天瑞达实业有限公司，海南 白沙 572800)

赤芝GanodermalingzhiSheng H.Wu，Y.Cao & Y.C.Dai在分类上隶属于多孔菌目Polyporales灵芝科Ganodermataceae[1]，是一种传统的药用真菌，具有补气安神，止咳平喘的功效，用于心神不宁，失眠心悸，肺虚咳喘，虚劳短气，不思饮食[2]。现代药理学研究表明，灵芝具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抑菌、保肝护肝等多种作用[3]。灵芝含有400多种生物活性化合物，包括多糖、三萜、核苷酸、甾体、甾醇、脂肪酸和多肽等[4]。灵芝多糖多提取于灵芝的子实体、菌丝体、孢子中，是灵芝的主要活性成分之一，具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、 降血糖、神经保护、抗衰老、抗疲劳、抗炎等功能特性[4]。灵芝所含有的灵芝酸，为植物所没有，各种灵芝中分离得到的灵芝酸已达100多种[4]。灵芝酸为保护肝功能的主要成分，具有护肝、解毒和止痛等药理活性[4]。如灵芝酸H和灵芝酸A能够抑制乳腺癌细胞的转移和增殖[4，5]，灵芝酸B，A和C能抑制人白血病细胞HL-60的生长[4，6]。

海南地处热带，分布有赤芝等众多的灵芝科真菌[1]。但近年来，由于人们在海南对野生灵芝科真菌进行过度采集，包括赤芝在内的野生灵芝逐年减少[7]。因此在保护野生灵芝种质资源的基础上，对赤芝等进行人工栽培已经成了当务之急。同时，为了满足人们追求绿色健康产品的需求，进行仿野生栽培已经成了一种重要的栽培方式。在海南，人工栽培的橡胶树Heveabrasiliensis(Willd.ex A.Juss.)Muell.Arg.占据了海南很大的面积，具有大量的林下空间。为了充分利用橡胶树林下的闲置空间，我们进行了橡胶树林下赤芝的栽培。此外，我们在橡胶树林下采用不同的栽培方式，并检测不同栽培模式下赤芝子实体多糖和灵芝酸的含量，为橡胶-赤芝复合栽培模式的构建提供基础数据。

1 栽培场地

海南省白沙县元门乡红茂村委会方什村人工栽培橡胶树林下；安徽省霍山县野生阔叶林下。

2 赤芝栽培方法

以栓皮栎QuercusvariabilisBlume的茎为菌材，采用段木栽培方法，具体方法和步骤参见兰进等[8]。

3 材料与方法

3.1 实验材料、主要试剂与仪器

3.1.1 实验材料

赤芝菌种“琼2号”为海南野生赤芝子实体分离获得；测量多糖和灵芝酸的赤芝子实体为海南橡胶林下仿野生栽培、成熟状态的子实体，同时以安徽省霍山县阔叶林下、采用埋土方式、仿野生栽培的成熟子实体为对照。凭证标本保存于海南医学院真菌标本馆(FHMU)。

3.1.2 主要试剂

硫酸(分析纯)、蒽酮(分析纯)、乙醇(分析纯)、磷酸(分析纯)、甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)，无水葡萄糖、灵芝酸等对照品购自成都普斯生物科技有限公司。

3.1.3 主要仪器

T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，AL104精密电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，DHG-9076A电热鼓风恒温干燥箱(上海博讯实业有限公司)，HH-4数显恒温水浴锅(金坛市亿能实验仪器厂)，KQ-100V型超声波清洗器(上海锦玟仪器设备有限公司)，TGL-16G高速台式离心机(上海安亭科学仪器有限公司)，KDC-4 低速离心机(科大创新股份有限公司)，LC-2030高效液相色谱仪(日本岛津公司)。

3.2 紫外可见分光光度法测定赤芝多糖的含量

3.2.1 赤芝多糖的提取

取赤芝子实体粉末1.0 g，精确称定，于100 mL具塞锥形瓶中加入20 mL蒸馏水，超声30 min。抽滤样品，用5 mL蒸馏水冲洗瓶中残余药渣及滤纸，总滤液约25 mL于蒸发皿中水浴80 ℃蒸干/烘箱100 ℃烘干。向蒸发皿中残余物加4 mL蒸馏水，将粗多糖溶解移至50 mL离心管中，再加入1 mL蒸馏水继续溶解转移粗多糖，共得到5 mL多糖溶液。向50 mL离心管中加入乙醇至47.5 mL，4 ℃静置12 h以上，5000 rpm 离心15 min后弃上清液，将离心管开盖水浴蒸干得到赤芝粗多糖样品。

3.2.2 赤芝多糖含量测定标准曲线的绘制

配制120 μg/mL的无水葡萄糖对照品溶液，精密量取对照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，分别置具塞试管中，加蒸馏水至2.0 mL，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液(精密量取蒽酮0.1 g，加硫酸100 mL使之溶解，摇匀)6 mL，立即摇匀，放置15 min后，立刻冰浴15 min，取出，以相应试剂为空白，在625 nm波长处测定吸光度值。以吸光度值为横坐标，浓度为纵坐标，绘制标准曲线。计算回归方程为Y=0.0012X-0.0013，R2=0.9993，线性范围0.00～735 μg/mL。

3.2.3 赤芝粗多糖供试品溶液的制备

向装有赤芝粗多糖的离心管中加入5 mL蒸馏水，超声5 min使其溶解，将溶液连同沉淀物转移至10 mL离心管，充分摇匀使沉淀物分散，离心10 min，将上清液转移至新的10 mL离心管，得到多糖溶液，-20 ℃保存。取1 mL多糖溶液，定容于10 mL容量瓶作为供试品溶液。

3.2.4 赤芝多糖的含量测定

用移液枪取供试品溶液1 mL于具塞试管中，加入1 mL蒸馏水，使用10 mL移液管迅速加入6 mL硫酸蒽酮溶液，立刻摇匀，放置15 min后立刻置于冰浴中冷却15 min，取出，以2 mL蒸馏水加6 mL硫酸蒽酮溶液为空白，使用紫外可见分光光度计在625 nm波长处测定吸光度。

3.3 HPLC法测定赤芝中灵芝酸的含量

3.3.1 供试品溶液的制备

取干燥的赤芝子实体粉末2.0 g，精密称定，置150 mL具塞锥形瓶中，用移液管准确加入40 mL乙醇，超声20 min后摇匀抽滤，收集滤液，药渣再次加40 mL乙醇超声20 min，收集合并两次滤液，将滤液38 ℃真空干燥，用色谱甲醇定容至5 mL，过0.45 μm滤膜，取续滤液即得。

3.3.2 灵芝酸含量测定的色谱条件

测定波长：257 nm；色谱柱：安捷伦Angilant PromosilC18(2.1 mm× 15 cm，5 μm)；柱温：25 ℃；流速：0.4 mL/min；进样量：5 μL。梯度洗脱程序如表1所示。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution procedures

3.3.3 灵芝酸A 的含量测定线性方程

分别取灵芝酸A溶液(1.0 mg/mL)200 μL、300 μL、400 μL、500 μL于1 mL容量瓶中，用甲醇(HPLC级)定容至刻度得0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL灵芝酸A溶液，分别HPLC进样5 μL，制作灵芝酸A标准曲线，灵芝酸A标准曲线方程为Y=14299X-7543.3，R2=0.9961，线性范围0～500 μL。取适量灵芝酸A标准品，加HPLC甲醇配制为0.1 mg/mL的标准品溶液，4 ℃保存，作为每次进样时的对照品。

3.3.4 灵芝酸的含量测定

使用岛津LC-2030高效液相色谱仪测定10种灵芝酸，各灵芝酸对照品相对灵芝酸A的近似相对保留时间如表2所示。

表2 灵芝酸对照品相对灵芝酸A的近似相对保留时间Tab.2 The approximate relative retention time of each ganoderic acid compared with that of ganoderic acid A

图1 灵芝酸A标准品及赤芝样品中各灵芝酸HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of ganoderic acid A and each ganoderic acid in G.lingzhi sample

根据标准品灵芝酸A(峰6)的保留时间与其他9种灵芝酸的相对保留时间，指认峰1，2，3，4，5，6，7，8，10分别为灵芝烯酸C，灵芝酸C2，灵芝酸G，灵芝烯酸B，灵芝酸B，灵芝酸A，灵芝酸H，灵芝烯酸D，灵芝酸F。灵芝酸D出峰时间在34.2 min，所有样品中灵芝酸D含量都小于0.04%，峰无法显示。分别计算赤芝子实体中每种灵芝酸的百分比：含量测定结果=(ru/rs)×Cs×(V/W)×F×100%。ru=样品溶液中相关分析物的峰面积，rs=标准溶液A中的灵芝酸A的峰面积，Cs=标准溶液A中灵芝酸A标准品的浓度(mg/mL)，V=样品溶液的体积(mL)，W=用于制备样品溶液的灵芝子实体的重量(mg)，F=相对于灵芝酸A的相对响应因子。

4 结果

海南橡胶林下不同栽培方式获得的赤芝子实体，其多糖含量如表3所示。与对照即安徽阔叶林下埋土栽培的赤芝子实体中多糖的含量相比，海南橡胶林下不同栽培方式获得的赤芝子实体的多糖含量均较高，且和对照均有明显差异。另外，海南橡胶林下三种栽培方式对赤芝子实体中多糖含量的影响无明显差异。

表3 海南橡胶林下不同栽培方式赤芝子实体的多糖含量Tab.3 The content of total polysaccharides in the fruit body of G.lingzhi cultivated by different methods under artificial forests of H.brasiliensis in s.d.，n=3)

海南橡胶林下不同栽培方式中赤芝子实体的灵芝酸含量如表4所示。对照即安徽阔叶林下埋土栽培的赤芝子实体，其灵芝酸G、灵芝烯酸B、灵芝酸A、灵芝酸H、灵芝烯酸D、灵芝酸F、总灵芝酸含量均高于海南橡胶林下三种栽培方式的赤芝子实体，且具有显著性差异。海南橡胶林下埋土栽培方式获得的赤芝子实体灵芝酸C2含量最高；埋土及半埋土栽培方式的赤芝子实体中灵芝酸B含量较高；不埋土和半埋土栽培方式获得的子实体，其灵芝烯酸C2较高。

表4 海南橡胶林下不同栽培方式赤芝子实体的灵芝酸含量Tab.4 The content of ganoderic acids in the fruit body of G.lingzhi cultivated by different methods under artificial forests of H.brasiliensis in s.d.，n=3)

5 讨论

海南是中国最大的天然橡胶主产区和种植基地[8]，具有丰富的橡胶林下空间，那么如何利用这些空间，使其获得更好的林农业生产效益，是当下要解决的一个重要问题。目前，橡胶林复合种植模式被认为是解决这些问题的有效手段[9]。国内，橡胶林下有橡胶-大叶千斤拔、橡胶-茶叶、橡胶-益智、橡胶-可可等多种复合种植模式[9]。虽然也有橡胶-灵芝的复合种植模式，但却没有受到足够重视，且缺少深入的研究[10]。本研究采用赤芝段木菌棒不埋土、半埋土、全埋土三种不同的栽培方式，并对其多糖和灵芝酸含量进行测定。研究结果表明，栽培方式对赤芝子实体多糖含量没有显著影响(表3)，但海南橡胶林下三种栽培方式获得的子实体多糖含量均比对照即安徽阔叶林下埋土栽培的赤芝子实体多糖含量高，且具有显著性差异(表3)。这说明橡胶林下适合栽培对多糖含量要求高的赤芝子实体。此外，在2020年版《中华人民共和国药典》中规定紫外分光光度法检测的总多糖含量不得少于干重的0.9%，本研究中各种不同栽培方法下，其多糖的含量均达到了《中国药典》规定的量。

灵芝酸结构和种类多样，具有多种药理作用。日本对灵芝商品及灵芝制品中的灵芝酸非常重视，是鉴定商品质量的标准，认为三萜类灵芝酸含量越高，灵芝产品质量越好。因此对各种灵芝酸的含量测定具有重要的意义。本论文中，海南橡胶林下不埋土和半埋土栽培方式获得的子实体，其灵芝烯酸C较高；全埋土栽培方式获得的子实体，其灵芝酸C2最高；半埋土和全埋土栽培方式获得的子实体，其灵芝酸B较高(表4)；三种不同栽培方式对总灵芝酸的含量均没有显著影响(表4)。此外，《美国药典》规定通过HPLC法检测灵芝酸不得少于干重的0.3%，本研究中海南橡胶林下各种不同栽培方法获得的子实体，其总灵芝酸的含量均达到了《美国药典》规定的量。

在中国，各地因地制宜，采用合适的模式进行赤芝的栽培。本论文采用的橡胶林下赤芝仿野生栽培，不仅符合海南省生态文明建设的需求，而且品质优良，其有效成分多糖和灵芝酸均达到或超过相关规定要求的量。此外，由于海南常年无冬，在全年的大部分时间段，赤芝都可以栽培和采收，而不像国内其他地区，一年只能进行一次栽培和一次采收。因此，综合以上来看，在海南构建橡胶-赤芝复合栽培模式是完全可行的。