和耀威，李 鹏，向 准，熊 雪，杨 玲，杨彝华

(贵州省生物研究所，贵州 贵阳 550009)

0 引言

毛木耳Auriculariacornea属木耳科木耳属Auricularia[1]，属于典型的白腐真菌，其有较强的产生木质素酶的能力[2]，能够降解较多木质素。生长范围广泛，山间、田间都有分布，主要生长在阔叶树的腐木上。毛木耳主要用来食用，入口脆而滑，凉拌食用更爽口[3]。

木质纤维素中的纤维素、半纤维素和木质素含量分别为40%～50%、25%～30%、20%～25%[4]。降解木质素的主要成分有放线菌和细菌，还有真菌，其中真菌(褐腐真菌、白腐真菌等)降解能力在3种成分中最强[5]。木质素所需的降解酶有漆酶，有过氧化物酶，还有锰过氧化物酶。漆酶的另一名称为苯二醇氧化还原酶，是一种含有铜的多酚氧化酶[6]，它主要来自生漆和真菌之中。真菌漆酶属于一种蛋白质，能催化和氧化较多的酚类以及非酚类的化合物[7]，降解木质素。漆酶在菌类栽培中起着重要作用，它降解培养基质中的木质素，使原基分化得到促进，从而对子实体的形态及生长发育产生影响[8]。漆酶活力情况与栽培基质细胞壁中木质纤维素降解情况一致，降解木质纤维素需要真菌，这也表明菌株对基质中木质纤维素的降解能力越强，产漆酶的能力也就越强。漆酶活力在食用菌栽培中扮演着重要的角色。目前为止对于毛木耳的研究，多数研究的是胞外酶活力影响因素的内容，而对漆酶活力的研究还较少，对产漆酶活力影响的研究也主要是离子以及浓度[9]，复合型培养基，还有对诱导物的粒子孔径情况等因素[10]，对于含不同木质纤维素的栽培基质对菌株产漆酶活力的研究还较少，因此本研究以毛木耳781菌株作为研究对象，探索4种栽培基质诱导对其产漆酶能力的影响，筛选优化出高产漆酶的木质纤维素栽培基质，从而为提高和改善毛木耳781的产量和品质奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试毛木耳781菌株，由贵州省食用菌工程技术研究中心提供。生物工程(上海)有限公司购买了Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒。

1.2 培养基

麦芽浸粉琼脂培养基(MEA)：葡萄糖10 g、麦芽浸粉20 g、KH2PO43 g、琼脂20 g，恒定体积至1 L，121 ℃下杀菌30 min。

基本培养基(BM)：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、MgSO40.5 g、KH2PO41 g，恒定体积至1 L，121 ℃下杀菌30 min。

基本培养基(BM)添加木屑：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、MgSO40.5 g、KH2PO41 g，恒定体积至1 L，加3 g孔径为20～60目的青杠树木屑，121 ℃下杀菌30 min。

基本培养基(BM)添加玉米芯：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、MgSO40.5 g、KH2PO41 g，固定体积至1 L，加3 g孔径为20～60目的玉米芯，121 ℃下杀菌30 min。

基本培养基(BM)添加棉籽壳：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、MgSO40.5 g、KH2PO41 g，固定体积至1 L，加3 g孔径为20～60目的棉籽壳，121 ℃下杀菌30 min。

基本培养基(BM)添加麦麸：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、MgSO40.5g、KH2PO41 g，恒定体积至1 L，加3 g孔径为20～60目的麦麸，121 ℃下杀菌30 min。

1.3 培养方法

将保存的毛木耳接种于固体MEA平板培养基上，25 ℃恒温培养活化8 d。在活化好的平板上，以同心圆在平板边缘打孔，孔径大小为5 mm，并在每100 mL基本培养基中接入4个菌块，放入温度为25 ℃的恒温摇床中培养，恒定转速为150 r/min。7 d后，用匀浆机搅拌瓶中的菌丝球30 s，使其变得均匀。向分别含3 g木屑、3 g玉米芯、3 g棉籽壳和3 g麦麸的100 mL基本培养基的250 mL三角瓶中加入3 mL搅拌均匀的均质体，于25 ℃、150 r/min摇床避光培养。每个实验重复3次。

1.4 ITS序列分析

用试剂盒提取、分离、纯化菌株DNA，并用通用引物(ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC)进行PCR扩增。采取25 μL的PCR反应体系：Template(基因组20～50 ng·μL-1)0.5 μL；10×Buffer(和Mg2+)；dNTP(各2.5 mM)1 μL；Taq0.2 μL；F(10 μM)0.5 μL；R(10 μM)0.5 μL；加双蒸水至25 μL。反应体系在94 ℃预变性4 min，在94 ℃变性45个循环，在55 ℃退火45个循环，在72 ℃延长1 min，30个循环，72 ℃延长8 min，在4 ℃终止保存。经扩增之后得到的PCR产物再通过1.0%的琼脂糖电泳检测扩增，最后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序后登陆GenBank对比，通过BLAST对测序结果进行比对分析，下载最相近菌株的ITSrDNA序列，并构建系统发育树。

1.5 酶活测定

发酵液经双层滤纸抽滤后，并于5 ℃低温条件下12000 r/min离心20 min，上清液即为粗酶液。

漆酶活性测定：1 mL1 mmol/L2，2’-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)[2，2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonicacid)，ABTS]底物、1.9 mL50 mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.2)和100 μL适当稀释的酶液，共同构成3 mL反应体系，在420 nm位置测定5 min范围内吸光值的变化。每分钟转化1 μmolABTS所需的酶量则定义为一个活性单位。420 nm处ABTS摩尔吸光系数为3.6×104L/(mol·cm)。

1.6 统计学分析

以上所得数据使用SPSSStatistic18.0进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 DNA的提取及ITS序列分析

实验样品送往生工生物工程(上海)股份有限公司做分子鉴定检测，经PCR扩增和序列测定，结果显示毛木耳781(ITS781)的rDNAITS区段长度为607 bp，所得序列进行Blast搜索，在Blast击中结果中下载e值达99.8%以上的序列，包含Auriculariapolytricha、Auriculariacornea2种，均为木耳科木耳属毛木耳[11-12]。再下载8种不同木耳属菌株(Auriculariafuslosuccinea、Auriculariareticulata、Auriculariadeicata、Auriculariaamericana、Auriculariaheimuer、Auriculariaauricula-judae、Auricularianigricans和Auriculariavillosula)rDNA序列共同构建系统发育树(图1)。系统发育树表明，本试验供试菌株测序结果同毛木耳相似性高达98%以上，所以，供试菌株为毛木耳下的一个分支。

图1 ITS 序列构建的毛木耳系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of Auricularia cornea constructed based on ITS sequence

2.2 不同诱导培养基对漆酶活性的影响

通过单因素方差检验分析得出：毛木耳781菌株在4种培养基中表现出产漆酶能力不同。4种含不同木质纤维素的诱导培养基对菌株漆酶活性均有显著影响。4种不同诱导培养基对毛木耳781菌株漆酶活性影响极显著(P<0.001)(表1)。

表1 4种诱导培养基对毛木耳781漆酶活力的影响(单因素方差检验)Tab.1 Effect of four substrates on the laccase-producing activity of Auricularia cornea 781(one-way ANOVA)

基本培养基(BM)加棉籽壳，在第1天就能检测到漆酶活力，但活力很低，在4种诱导培养基中最低，为(1.94±0.82)U/L；第2天急剧上升，在第5天时达到最大漆酶活力，为(140.22±8.65)U/L(表2)，到第9天时下降到(72.33±0.39)U/L(图2)。

表2 毛木耳781在不同诱导培养基条件下的最大漆酶活力及出现的时间Tab.2 Maximum laccase-producing activity and appearance time of Auricularia cornea 781 in different substrates

图2 毛木耳781在含棉籽壳的液体发酵条件下漆酶活性的变化Fig.2 Changes of laccase-producing activity of Auricularia cornea 781 in cotton seed husk substrate

基本培养基(BM)加麦麸，在第1天就能检测到漆酶活性，为(2.15±0.56)U/L；第4天急剧上升，第5天时达最大漆酶活性，为(355.28±9.01)U/L(表2)，第8天急剧下降，第9天时降到(54.11±7.51)U/L(图 3)。

图3 毛木耳781在含麦麸的液体发酵条件下漆酶活性的变化Fig.3 Changes of laccase-producing activity of Auricularia cornea 781 in wheat bran substrate

基本培养基(BM)加木屑，第1天漆酶为(3.68±0.50)U/L；第3天出现下降，第4天急剧上升，在第5天时达到最大漆酶活性，为(62.50±1.04)U/L(表2)，第7天出现回升后第8天下降，到第9天时下降到(37.33±1.84)U/L(图4)。

图4 毛木耳781在含木屑的液体发酵条件下漆酶活性的变化Fig.4 Changes of laccase-producing activity of Auricularia cornea 781 in sawdust substrate

基本培养基(BM)加玉米芯，第1天就有漆酶活性，且在4种培养基中最高，为(26.44±0.52)U/L；第3天出现下降后第4天上升，在第5天时达到最大漆酶活性，为(79.94±4.13)U/L(表2)，到第9天时下降到(22.94±1.59)U/L(图5)。

图5 毛木耳781在含玉米芯的液体发酵条件下漆酶活性的变化Fig.5 Changes of laccase-producing activity of Auricularia cornea 781 in corncob substrate

总体而言，4种诱导培养基均能在第1天检测到漆酶活力，第5天达到最大漆酶活力，第6天开始下降，整体活力趋势相似。漆酶活力依次为BM+麦麸>BM+棉籽壳>BM+玉米芯>BM+木屑，基本培养基(BM)加麦麸漆酶活力最大，且远高于其他3种诱导培养基，基本培养基(BM)加木屑漆酶活力最小。在4种木质纤维素类添加剂中相比，麦麸对毛木耳781漆酶的诱导作用强于木屑、棉籽壳和玉米芯。

3 结论与讨论

随着研究真菌和木质纤维素两者间关系以及真菌降解木质纤维素情况的不断完善，菌株产漆酶等酶类与不同的木质纤维素原料的关系也已有相应的结论，有研究表明通过对香菇、侧耳的某些种进行实验得出含有不同的木质纤维素基质培养菌株，会对菌株锰过氧化物酶和漆酶等的产出产生影响[13]。此外有研究发现，担子菌的产酶会受到不同的木质纤维素材料的刺激[14]。以毛木耳781菌株为研究对象，在液体发酵过程中添加不同的木质纤维素原料进行诱变，连续发酵后对其漆酶活性进行测定，同一培养条件下毛木耳781菌株漆酶分泌能力差异显著(p<0.01)。所得结果与已有的研究一致。

农林生产中的废弃物在现实生活中较为常见，利用其进行食用菌的栽培，一方面减少了环境的污染，另一方面为食用菌发展所用，循环利用，增加产业收益，助推产业振兴。麦麸、木屑、棉籽壳和玉米芯在农林生产中很有代表性，也是食用菌栽培常用添加物，4种原料的纤维素、半纤维素和木质素含量有一定的差距。玉米芯和棉籽壳中的半纤维素含量为31.9%和34.6%，玉米芯和棉籽壳中木质素含量为17.3%和31.7%[15]。此外也有研究结果表明：用胡桃壳和玉米芯作为诱导物，通过固体发酵形式对硬毛粗毛盖孔菌Funaliatrogii进行产漆酶活力研究时发现，两者漆酶活力分别为2206 U/L和198 U/L，差距很大[16]。本研究中的漆酶活性为棉籽壳高于玉米芯，结果和前人研究相似。

本研究中，菌株在4种诱导物培养下产漆酶活力的变化规律为：前期属于菌株初始生长期，分泌酶较少，漆酶活力较低；中期菌株进入快速增长阶段，菌丝发生量快速增长，漆酶活力逐渐增大到达最大值；后期诱导培养基营养物质被消耗，菌丝发生量逐渐降低，漆酶活力逐渐下降。4种诱导物诱导毛木耳781产漆酶活力的能力分别为：麦麸>棉籽壳>玉米芯>木屑，说明麦麸更适合作为毛木耳781菌株的木质纤维素诱导基质和栽培基质，更有利于菌株生长、提高产量和改善品质；为毛木耳品种的引种示范和规模化、标准化推广奠定基础。