◎ 林 巧，苏姣姣，刘军华，李 成，张 忠，蔡 利，舒一梅

（1.西昌学院，四川 西昌 615000；2.凉山州天美益农业科技有限公司，四川 西昌 615000；3.新希望集团西昌希望饲料公司，四川 西昌 615000）

指纹谱图是一种多方位、全面的、可量化的综合检测技术，其通过一系列的分析手段获得具有专一性、代表性和特征性的色谱或光谱[1]，在鉴别产品真伪方面发挥着一定的作用[2]。现在，在食品行业里HPLC指纹图谱技术已得到合理的运用，尤其是在中药领域，指纹图谱技术已经被广泛应用且取得重大成就[3]。此外，指纹图谱在白酒质量控制上也具有一定的意义[4]。研究表明，在某些白酒生产加工过程中，以指纹图谱为依据可以有效地解决白酒中成分复杂、不定性的问题[5]，再进行严格地监督和合理地指导，就可以保证白酒质量的稳定性。然而，上述指纹图谱作用是否对马铃薯白酒同样有效是值得考查和研究的，建立其指纹图谱也是极具意义的。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

甲醇溶液出自成都市科隆化学品有限公司，其纯度大于99.7%；冰乙酸为色谱纯；乙酸正丁酯为罗恩试剂，其纯度大于99.0%；10个批次的马铃薯酒。

安捷伦1260高效液相色谱仪，真空过滤装置，超声装置，安捷伦Eclipse Plus C18色谱柱。

1.2 实验条件

色谱流动相为0.5%的乙酸（A），甲醇（B）；选择以下梯度条件分离：25%的A和75%的B（10 min），45%的A和55%的B（15 min），65%的A和35%的B（25 min）；选择安捷伦色谱柱；流速为0.8 mL·min-1，柱温左右均为30 ℃，进样量为20 μL，检测波长为290 nm。

1.3 样品处理

取各批次的马铃薯酒25 mL到50 mL的容量瓶中，随后加入5 mL内标液（乙酸正丁酯[6-7]），再用60%的甲醇水溶液定容至容量瓶刻度线处，摇晃混合均匀后，样品溶液用0.45 μm的微孔滤膜过滤，最后取溶液到样品瓶内用于后续检测。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 马铃薯酒HPLC指纹图谱的获取

为使马铃薯酒样各成分能够充分地分离，通过一系列的预实验以及优选合适的流动相比例以确定最优的条件。在检测波长为290 nm时，得到的图谱基线平稳且色谱峰较丰富，所以该试验的检测波长确定为290 nm。在高相液相色谱仪中将配制好的马铃薯酒样溶液运行60 min后，发现获得的图谱在15 min后基线平稳且不再有组分色谱峰出现，故色谱检测时间确定为15 min。

2.1.2 马铃薯酒HPLC指纹图谱的稳定性试验

将10个批次的马铃薯酒按照1.3样品处理步骤配制成10份酒样溶液，再根据优选的色谱条件进样检测得到它们的指纹图谱，并计算各色谱峰相对于参照峰（乙酸正丁酯峰）的相对保留时间和相对峰面积，及对应的相对标准偏差（RSD），探究高效液相色谱法指纹图谱的稳定性。结果表明，这10个批次的马铃薯酒的相对保留时间的相对标准偏差（RSD）在0.2%～0.3%，相对峰面积的RSD在0.5%～2.0%，所以这10批马铃薯酒样的稳定性良好。

2.1.3 马铃薯酒HPLC指纹图谱的精密度试验

为了考查HPLC指纹图谱的精密度，把每一批次的马铃薯酒按照1.3样品处理步骤配制为样品溶液1份，每一份样品溶液都需在高效液相色谱仪中连续进样6次。根据色谱图中的保留时间和峰面积来计算各组分色谱峰相对于参照峰的相对保留时间和相对峰面积。通过计算和分析，整理得到表1，结果表明酒样色谱峰相对保留时间的RSD在0.080%～0.80%，相对峰面积的RSD在0.2%～0.9%，由此可知这10批马铃薯酒的指纹图谱精密度良好。

表1 酒样进样6次的相对保留时间和相对峰面积表

续表1

2.1.4 马铃薯酒HPLC指纹图谱的重复性试验

为考查HPLC指纹图谱的重复性，将每一批次马铃薯酒按照1.3样品处理步骤制备成6份。将6份酒样溶液标号1、2、3、4、5、6，再进样并得到色谱图。选择色谱图的保留时间和峰面积来计算各组分色谱峰相对于参照峰的相对保留时间和相对峰面积。经过数据整理和分析得到表2，结果表明各组分色谱峰相对保留时间的相对标准偏差在0.08%～0.60%，相对峰面积的RSD为0.20%～0.80%，由此可知这10批马铃薯酒的重复性良好。

表2 10个批次酒样重复性试验的相对保留时间和相对峰面积表

2.2 马铃薯酒HPLC指纹图谱的建立

2.2.1 马铃薯酒试剂空白图谱

将配制马铃薯酒样品的溶剂作为空白试剂，然后按照色谱条件检测并得到空白图谱。图1为按照上述步骤得到的空白图谱，由图可知基线平稳，故配制酒样的溶剂不干扰供试品的检测。

图1 空白图谱图

2.2.2 马铃薯酒样品指纹图谱

按照1.3的样品处理步骤将10个不同批次的马铃薯酒配制成待测样品，经过进样检测获得它们的高效液相指纹图谱。通过比较、分析这些HPLC指纹图谱，获得有效的数据——保留时间、峰高和峰面积，并提取它们的共有峰建立最终的马铃薯酒指纹图谱。

2.3 指纹图谱分析

2.3.1 相对保留时间和相对面积的计算

相对保留时间为T=t1/t2，其中，t1为某个待测组分峰的保留时间，t2为参照峰的保留时间。相对峰面积为S=A1/A2，其中，A1为某个待测组分峰的峰面积，A2为参照峰的峰面积。

2.3.2 共有指纹峰的标定

从10个批次马铃薯酒的HPLC色谱图中提取相同或相似的组分峰，最终将色谱峰中6个共有组分峰作为马铃薯酒HPLC指纹图谱的特征峰。代入到上述2.3.1的公式，分别计算这10批马铃薯酒样中6个共有峰相对于参照峰的相对保留时间的平均值，它们分别为0.703 2、0.850 7、0.897 9、0.931 8、1.000 0（参照峰）、1.269 9，以上5个峰被选择为指纹图谱的特征峰，对此类马铃薯白酒产品质量鉴别具有一定的意义。结果分析整理见图2和表3。

图2 马铃薯酒指纹图谱图

表3 10批酒样5个共有峰的相对保留时间和相对峰面积表

2.3.3 指纹图谱相似度评价

将10个批次马铃薯酒样的高效液相色谱数据导入到《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（中国国家药典委会，2012.130723版本）。运用此系统对10批酒样进行相似度评价，10个批次马铃薯酒的HPLC指纹图谱见图3，相似度评价结果见表4。

由图3马铃薯酒的HPLC指纹图谱可以直观地看出这10个批次的酒样在多个色谱峰具有明显地重合，这说明马铃薯酒色谱峰具有较好的一致性。表4马铃薯酒的相似度分析结果表明，这10个批次酒样指纹图谱的相似度均在0.953之上，马铃薯酒样之间的相似度也在0.926之上。通过以上一系列分析可知，这10批马铃薯酒质量较稳定且具有良好的一致性，所以建立的马铃薯酒指纹图谱具有一定的信服力。

表4 马铃薯酒样相似度分析表

图3 马铃薯酒指纹图谱相似度评价结果图

2.4 马铃薯酒指纹图谱的验证试验

为探究马铃薯酒指纹图谱的可行性，准备两种类型的酒样，分别是马铃薯酒、北京二锅头。两种白酒分别按照1.3样品处理步骤配置成酒样并在相同的条件下进样检测，并将得到的两个色谱峰重叠到一个图，结果见图4。结果表明，位于下面的色谱图与马铃薯酒指纹谱图相似且多处共有峰重叠较吻合，而位于上面的色谱图与马铃薯酒指纹图谱差异较大，以此区分出了马铃薯酒和北京二锅头，所以马铃薯酒指纹图谱具有可行性且较为可靠。

图4 马铃薯酒和北京二锅头HPLC指纹图谱的重叠图

3 结论与讨论

经过对指纹图谱数据的整理和分析得到了各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。通过对比10个批次马铃薯酒样品相对保留时间和相对峰面积的差异，对10个批次的马铃薯酒做了相似度评价。结果表明，通过对10批马铃薯酒的指纹图谱优化5个共有特征峰，并且它们的相似度在0.926以上，说明相似度差异较小。目前指纹图谱在中药领域中被广泛应用，而本次试验得到的马铃薯酒HPLC指纹图谱能够发现马铃薯酒的特征峰，能够反映该酒的整体组分情况。

本实验通过一系列的操作、分析，优选试验条件和优化试验步骤流程最终获得了马铃薯酒的指纹图谱，且一系列验证试验结果表明高效液相色谱法用于马铃薯酒指纹图谱的研究是方便可靠的、易行的，高效液相色谱法可以方便且有效地用于马铃薯酒的质量控制和掺伪检验，而此方法是否能用于其他白酒或其他领域还有待进一步研究。