何海宁，刘海龙，杨光瑞，袁彩霞*，洪霞

1.甘肃中商食品质量检验检测有限公司（兰州 730010）；2.甘肃省商业科技研究所有限公司（兰州 730010）

乳制品安全是近年来食品安全的焦点之一[1-2]。检测新技术运用滞后，部分标准缺乏，导致乳制品不安全事件屡禁不绝[3]。乳制品污染多见于原料乳的后期添加不当，如为使乳及乳制品保鲜，向乳中添加过量硫氰酸钠，若保存条件不当会是硫氰酸转化成氰基造成食品污染[4-5]；杏仁露中的有害物质之一氰化物主要来源于配料苦杏仁及保存条件不当产生[6-7]。研究表明，氰化物是一类有氰基（CN-）的剧毒化合物，氰根离子（CN-）进入人体后，主要作用于血液，能抑制组织细胞中40多种酶的活性引起整个细胞色素体系的氧化还原障碍，导致机体的氧化还原作用停止，造成细胞窒息，组织缺氧[8-10]。因此，为确保人类身体健康和食品安全，建立快速、有效、经济、环保的乳制品化学性污染的检测具有重要意义[11-13]。

相关文献显示，食品中氰化物的检测方法主要有分光光度法[14]、气相色谱法[15]、离子色谱法[16]、气相色谱-质谱联用仪[17]、液相色谱法[19]等。但这些方法检测效率低，干扰大，数据不可靠，不适用于杏仁露中氰化物的快速检测[20]。因此，试验设计一种用β-环糊精功能化石墨烯负载金纳米粒子复合材料构筑生物传感器快速检测复杂基质杏仁露中氰化物的方法。采用β-环糊精功能化石墨烯，极大地提高石墨烯在水中的溶解度和分散性，功能化石墨烯表面负载金纳米粒子复合物构筑生物传感器对杏仁露中氰化物具有很好的选择吸附性。利用该纳米复合物构筑电化学生物传感器对杏仁露中氰化物进行快速检测，操作简单快速、重现性好、选择性高。数据可靠，干扰小，检测的灵敏度高，分析速度快，实用性强。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

水中氰成分分析标准物质（99.8%，北京北方伟业计量技术研究院）；磷酸（99.8%，国药集团化学试剂有限公司）；氯胺T（99.3%，中国计量科学研究院）；丙酮（色谱纯，99.6%，西安市永红化工原料公司）；正己烷（色谱纯，99.6%，西安市永红化工原料公司）；杏仁露样品（兰州市华联超市同期生产的杏仁露）；二次蒸馏水。

1.2 仪器与设备

电子天平（XS 225A-SCS）；涡旋振荡仪（GENIUS3）；移液管；吸耳球；台式高速离心机（CF16RXⅡ）；超声波清洗机（SB-100B）；电化学工作站（CHI600E）。

1.3 试验方法

1.3.1 金纳米粒子的制备

采用抗坏血酸还原法制备金纳米粒子。制备过程：按体积比1∶1∶1.5∶25（总体积135～175 mL），分别取质量分数1%的氯金酸溶液、质量分数0.7%的抗坏血酸溶液、摩尔体积浓度0.2 mol/L的碳酸钾溶液和蒸馏水，将氯金酸溶液、碳酸钾溶液和蒸馏水混匀，在搅拌的条件下加入抗坏血酸溶液，立即呈现紫红色；加蒸馏水至500 mL，加热至溶液变为透明红色为止，制得粒径为10～15 nm的金纳米粒子。

1.3.2 氧化石墨烯表面的环氧功能化

按40 mL去离子水中加入10 mL质量体积浓度8 mg/mL的氧化石墨烯悬浮液和1.5 mL环氧氯丙烷的比例，分别取去离子水、氧化石墨烯悬浮液和环氧氯丙烷，氧化石墨烯悬浮液加入去离子水中，超声20～30 min，得到均一氧化石墨烯悬浮液；向该均一氧化石墨烯悬浮液中加入10%氢氧化钠溶液，待均一氧化石墨烯悬浮液的pH 9.5～10.0后，逐滴加入环氧氯丙烷，在60～80 ℃的温度下磁力搅拌3～4 h，离心，水洗3次，得环氧基团功能化氧化石墨烯。

1.3.3β-环糊精功能化石墨烯的制备

按质量比1∶10～1∶15，分别取环氧基团功能化氧化石墨烯和β-环糊精，将环氧基团功能化氧化石墨烯完全溶解于pH 9.5～10的碳酸缓冲溶液中，加入β-环糊精，在60～70 ℃的温度下磁力搅拌3～4 h，用14000 r/min的离心机离心10 min，水洗3次，冷冻干燥，得β-环糊精功能化的氧化石墨烯。

1.3.4 金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯复合物的制备

按质量比1∶6∶14分别取粉末状的4-氨基苯硫酚、β-环糊精功能化的氧化石墨烯和金纳米粒子，将4-氨基苯硫酚加入无水乙醇中，超声溶解，加入β-环糊精功能化的氧化石墨烯，超声30～40 min，加入金纳米粒子，磁力搅拌20～24 h；离心分离，干燥。

1.3.5 杏仁露中氰化物的提取及衍生

将硫酸铵溶液作为蛋白沉淀剂，加入杏仁露中，通过盐析法沉淀杏仁露中的蛋白质，通过离心分离，取上清液定容，在定容后的上清液中加入0.2 mL（1+5）磷酸溶液，涡流混合，加入0.3 mL 10 g/L的氯胺T溶液，立即加盖密封，涡流混合得到衍生液。

1.3.6 标准溶液配制

氰离子标准系列工作溶液的配制：将购买的水中氰成分分析标准物质配制成10 mg/L储备液并于冰箱保存，使用时将其储备液用水稀释成质量浓度为0，0.001，0.002，0.010，0.050和0.100 mg/L的标准系列工作溶液。准确移取10 mL标准工作溶液于顶空瓶中，加入0.2 mL磷酸溶液（1+5），涡流混合，加入0.3 mL 10 g/L的氯胺T溶液，立即加盖密封，涡流混合得到衍生液。

1.3.7 电化学检测

将裸玻碳电极利用三氧化二铝粉末打磨干净并在红外灯下烘干；在打磨干净的裸玻碳电极表面滴涂1～2滴1 mol/L功能化石墨烯复合物分散液，自然晾干作为工作电极；以铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，将构成三电极电化学生物传感体系放入杏仁露中氰化物衍生液中，在电压-0.1～1.0 V，电流0～10 mA通过电化学工作站CHI600E可对氰化物的电化学性能进行研究。

2 结果与讨论

2.1 β-环糊精功能化石墨烯负载金纳米粒子复合材料的性能表征

图1（A）和（B）分别是氧化石墨烯纳米片的透射电子衍射图和β-环糊精功能化石墨烯负载金纳米粒子复合材料的扫描电子显微镜图。从图1（A）可以看出，氧化石墨烯表面的褶皱和每一个电子衍射区域，选定区域电子衍射模式说明利用化学法还原可以得到石墨烯纳米片晶体结构[21]。图1（C）和（D）分别是β-环糊精功能化石墨烯负载金纳米粒子复合材料的低倍和高倍透射电子衍射图，金纳米粒子均匀地分散在功能化石墨烯表面，金纳米粒子的大小为3～10 nm。结果表明，在形成大小均匀、稳定的金纳米粒子过程中β-环糊精起着重要作用，并且在长时间超声过程中金纳米粒子也不会从石墨烯表面上脱落，这说明金纳米粒子与功能化石墨烯表面具有强的相互作用。研究表明，金纳米粒子的尺寸减小到纳米尺度时，由于高的比表面积，表面原子数增多及表面原子配位不饱和性导致大量的悬挂键，使得纳米颗粒的活性远高于相应块体材料[22]。墨烯表面的β-环糊精可以有效地阻止石墨烯纳米片团聚使其活性面积降低[23]。由于金纳米粒子和β-环糊精的特异性及石墨烯大比表面积，提高了该电化学生物传感器的电化学性能。

图1 透射电镜和扫描电镜图

2.2 不同纳米复合物构筑电化学生物传感器对杏仁露中氰化物快速检测及性能研究

探究不同纳米复合物构筑电化学生物传感器对杏仁露中氰化物快速检测及性能，结果如图2所示。与裸玻碳电极、金纳米粒子修饰电极、石墨烯修饰电极相比较，该β-环糊精功能化石墨烯负载金纳米粒子复合材料修饰电极对杏仁露氰化物具有很好的电化学响应。

图2 不同纳米复合物构筑电化学生物传感器对杏仁露中氰化物快速检测及性能研究对比

2.3 复合材料构筑电化学生物传感器对不同浓度氰化物吸附性能研究

为考察该生物传感器的灵敏度及精确度，通过加标方式探讨该复合材料修饰电极对杏仁露不同浓度氰化物吸附性能。从图3可以看出，该纳米复合材料构筑电化学生物传感器对杏仁露中不同浓度氰化物具有良好线性关系，最低检出限为0.0056 mg/L。

图3 复合材料构筑电化学生物传感器对不同质量浓度氰化物吸附性能研究

2.4 杏仁露氰化物提取过程中衍生剂用量的选择

如图4所示，利用不含苦杏仁的杏仁露阴性样品作为分析物，准确移取7份20 mL该杏仁露于顶空瓶中，编号为1，2，3，4，5，6和，编号1试样作为空白，其他试样分别加入20 μL 0.05 mg/L的氰离子标准储备液，依次添加50，100，200，300，350，400和500 μL 10 g/L的氯胺T衍生剂溶液，从图4可以观察氯胺T的用量对响应值的影响情况。由试验数据可以看出，氯胺T用量达到300 μL后电化学响应最好，即可获得满意的试验结果。

图4 杏仁露氰化物提取过程中衍生剂用量研究

2.5 衍生pH的选择

根据有关文献显示，溶液的酸碱性对该传感器有很的大影响，因此可以在顶空瓶中通过加入浓磷酸达到调节pH的目的，结果见图5。通过观察对电流响应值的影响，结果表明，电流值随着pH增大而增大，溶液pH在5.5～6.5范围内时电流没有明显差别，所以选用pH 6作为试验条件。

图5 衍生pH的选择

2.6 沉积时间的选择

沉积时间是影响传感器电化学活性的主要因素之一，在阴性样品中加入30 μL 0.01 mg/L的氰化物标准溶液后，沉积时间选择20，30，35，40，50，55，60和65 min分别进行考察，结果见图6。结果显示，电极表面沉积时间50 min后即达到稳定，故最终沉积时间选择为50 min。

图6 沉积时间

2.7 方法的回收率和精密度试验

选用阴性杏仁露样品作为基质，取样品1和样品2各10 mL，分别加入30和50 μL 10 mg/L的氰离子标准储备液进行2个浓度水平添加回收试验，每个添加浓度水平做3个平行样品。方法的回收率和精密度（用相对标准偏差SRSD表示）数据见表1。

3 结论

试验提供一种用金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯复合物构筑电化学生物传感器，并用该电化学生物传感器快速检测杏仁露中氰化物的方法，该方法作为一种新颖的方法相对于现有技术中的色谱法、光谱法、生化法等对杏仁露中氰化物具有很好的选择性和稳定性。该方法操作简便、快捷，大幅缩短检测周期，同时对人体和环境安全，是一种环保、经济、快速的检测手段，试验线性关系良好，准确度和精密度较高，抗干扰小。该试验为杏仁露的质量保证提供支持，尤其是面对大批量样品的检测，更能体现方法的优越性。