盛 媛,朱蕴暖，刘 娜，刘存霞，于可响，胡 峰，郭效珍，李玉峰，刘丽萍，马秀丽，黄 兵

（山东省农业科学院家禽研究所 山东省禽病诊断与免疫重点实验室 山东省家禽育种工程技术研究中心，济南 250023）

鸭乙型肝炎病毒（Duck hepatitis B virus,DHBV），最早于1980年在北京麻鸭中被发现[1]，随后德国和其他国家相继报道[2-7]，DHBV与人乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）同属嗜肝DNA病毒科，其生物特性和发病机理与HBV类似，因此，鸭乙型肝炎动物模型常被用作抗HBV药物筛选及HBV致病机理研究的重要动物模型之一[2,7]。由于鸭子感染DHBV后往往无明显的临床表现，多数呈隐性带毒，并能导致持续性感染[8]。因此，迫切需要针对该病建立快速方便的检测方法。

常规PCR方法虽然操作简便，但灵敏度不高，巢式PCR、半巢式PCR虽然灵敏度较高，但是定量有一定难度，并不适合多样本的检测[9]。本研究根据鸭乙型肝炎病毒C基因保守区域设计一对特异性引物，建立了DHBV SYBR Green荧光定量PCR检测方法，用于DHBV的定量检测。该方法在临床样品的DHBV检测，DHBV感染雏鸭的药物动力学研究试验中，更为节省时间，且操作简便，灵敏度高。

1 材料与方法

1.1 试验材料 DHBV毒株LQM、鸭血清样品，均由山东省禽病诊断与免疫重点实验室分离保存。

1.2 主要试剂 SYBR Green Premix购自聚合美生物有限公司；核酸提取试剂盒、质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒等均购Genestar公司。

1.3 引物设计及合成 参照GenBank已发表的DHBV序列（GenBank登录号：MF471769.1）比对分析，设计一对特异性引物，P1：5'-GCCTTAGC CAATGTGTATGA-3'，P2：5'-GGTGGAACA GGAGTAGTAGT-3'，引物由深圳华大基因公司合成，扩增片段大小为278 bp。

1.4 阳性标准品的制备 按照全式金Easypure@Viral DNA/RNA Kit说明书提取DHBV阳性血清中的病毒DNA。……