盛 媛,朱蕴暖，刘 娜，刘存霞，于可响，胡 峰，郭效珍，李玉峰，刘丽萍，马秀丽，黄 兵

（山东省农业科学院家禽研究所 山东省禽病诊断与免疫重点实验室 山东省家禽育种工程技术研究中心，济南 250023）

鸭乙型肝炎病毒（Duck hepatitis B virus,DHBV），最早于1980年在北京麻鸭中被发现[1]，随后德国和其他国家相继报道[2-7]，DHBV与人乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）同属嗜肝DNA病毒科，其生物特性和发病机理与HBV类似，因此，鸭乙型肝炎动物模型常被用作抗HBV药物筛选及HBV致病机理研究的重要动物模型之一[2,7]。由于鸭子感染DHBV后往往无明显的临床表现，多数呈隐性带毒，并能导致持续性感染[8]。因此，迫切需要针对该病建立快速方便的检测方法。

常规PCR方法虽然操作简便，但灵敏度不高，巢式PCR、半巢式PCR虽然灵敏度较高，但是定量有一定难度，并不适合多样本的检测[9]。本研究根据鸭乙型肝炎病毒C基因保守区域设计一对特异性引物，建立了DHBV SYBR Green荧光定量PCR检测方法，用于DHBV的定量检测。该方法在临床样品的DHBV检测，DHBV感染雏鸭的药物动力学研究试验中，更为节省时间，且操作简便，灵敏度高。

1 材料与方法

1.1 试验材料 DHBV毒株LQM、鸭血清样品，均由山东省禽病诊断与免疫重点实验室分离保存。

1.2 主要试剂 SYBR Green Premix购自聚合美生物有限公司；核酸提取试剂盒、质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒等均购Genestar公司。

1.3 引物设计及合成 参照GenBank已发表的DHBV序列（GenBank登录号：MF471769.1）比对分析，设计一对特异性引物，P1：5'-GCCTTAGC CAATGTGTATGA-3'，P2：5'-GGTGGAACA GGAGTAGTAGT-3'，引物由深圳华大基因公司合成，扩增片段大小为278 bp。

1.4 阳性标准品的制备 按照全式金Easypure@Viral DNA/RNA Kit说明书提取DHBV阳性血清中的病毒DNA。以提取的DNA为模板，用设计的引物进行PCR扩增。扩增条件为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃再延伸5 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收纯化后，连接至pMD-18T载体上，将连接产物转化Trans 5α感受态细胞。筛选阳性重组质粒送擎科生物技术公司测序，鉴定正确的质粒命名为pMD18T-DHBV。该质粒作为阳性标准品，测定浓度并计算其拷贝数。

1.5 荧光定量PCR反应条件的优化及标准曲线的建立 采用矩阵法分别对退火温度（52、53、54、55、56、57℃）、引物浓度（终浓度分别为0.125、0.25、0.5、1 pmoL/μL）及模板量（1、2、3、4、5 μL）进行优化试验，确定荧光定量PCR最佳反应条件。将1.4制备的阳性标准品进行10倍梯度稀释，以10-2～10-8梯度稀释的质粒为模板进行荧光定量PCR扩增，每个稀释度做3个重复，建立标准曲线。

1.6 敏感性试验 将提取的DHBV病毒DNA模板作10倍系列稀释，用建立的荧光定量PCR进行扩增，验证该方法的敏感性。

1.7 特异性试验 分别提取鸭乙型肝炎病毒（DHBV）、鸭病毒性肠炎病毒（Duck viral enteritis virus，DCV）、Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus typeⅠ，DHAV-Ⅰ）、鸭坦布苏病毒（Duck Tambutsu virus，DTMUV）、鸭新型呼肠孤病毒（New duck reoviridae virus，NDRV）的DNA/RNA作为模板，用所建立的荧光定量PCR进行扩增，检测该方法的特异性。

1.8 重复性试验 将已知浓度的DHBV的核酸DNA进行10倍梯度稀释，取7.8×108copies /μL、7.8×106copies /μL、7.8×104copies /μL 3个稀释度为模板，每个浓度设3个重复，利用本试验建立的荧光定量PCR方法进行组内重复试验；每个模板在相同条件下反复进行3次独立的扩增，作为组间重复性试验。根据Ct值分别计算平均数、标准差和变异系数，验证该方法的重复性。

1.9 临床应用 从山东省不同地区规模化养鸭场采集的95份血清中提取病毒DNA，分别用建立的荧光定量PCR方法与常规PCR方法进行检测，比较两种方法的符合率。

1.10 DHBV感染雏鸭的动力学检测 选取代表毒株LQM感染3日龄雏鸭6只，另设对照组6只，分别于感染后1、5、7、9、11、13、15、17、19、22、25、28和31 d胫静脉采血，用建立的荧光定量PCR方法进行检测，分析LQM毒株感染雏鸭的动力学变化情况。

2 结果

2.1 阳性标准品的制备 以DHBV阳性血清提取的病毒DNA为模板，扩增的目的片段与预期大小一致（图1）。对构建的重组质粒进行测序，结果显示成功构建DHBV重组质粒，命名为pMD18T-DHBV，作为阳性标准品。测定其浓度并换算成拷贝数为7.8×1010copies/μL。

图1 DHBV DNA的PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification of the DHBV DNA

2.2 SYBR Green荧光定量PCR最佳反应条件 最终确定优化的反应体系20 μL：SYBR Green Premix 10 μL，上、下游引物（10 pmoL/μL）各0.5 μL，模板1 μL，灭菌ddH2O补足至20 μL。最佳反应条件：95℃预变性60 s；95℃变性15 s，56℃退火15 s，72℃延伸20 s，40个循环。

2.3 标准曲线的建立及熔解曲线分析 用建立的SYBR Green荧光定量PCR方法检测各梯度浓度的DHBV阳性标准品，该方法在7.8×108copies/μL～7.8×1 02copies/μL浓度范围内，呈 现良好的线性关系（图2A），相关系数（R2）为0.999，标准曲线方程为：y=-3.3925x+ 39.06，符合试验预期。确定Ct值为36时，为临界值。本试验建立的qPCR对阳性重组质粒的扩增产物溶解曲线显示，在熔解温度Tm为85.5±0.1℃时出现了唯一的特异性峰，无引物二聚体和非特异性扩增产物（图2 B）。

图2 qPCR方法的标准曲线（A）和熔解曲线(B)Fig.2 Standard curve (A) and melting curve (B) of the qPCR

2.2 敏感性试验结果 利用建立的荧光定量PCR和普通PCR对10倍梯度稀释的DHBV DNA模板进行检测，已测定原始DHBV的DNA浓度为17.287 ng/μL，结果显示，荧光定量PCR方法最低检出1×105倍稀释的模板，检出量为1.73 pg；而普通PCR方法最低检出103倍稀释的模板，检出量为173 pg（图3）。

图3 qPCR (A)与常规PCR (B)敏感性试验结果Fig.3 Sensitivity of the qPCR (A) and PCR (B)

2.3 特异性试验 利用建立的荧光定量PCR方法对DHBV、DCV、DHAV-1、DTMUV、N DRV进行检测，结果显示，除了DHBV为阳性外，其他病毒检测结果均为阴性。说明该方法具有良好的特异性（图4）。

图4 特异性试验荧光结果Fig.4 Amplification plot of the specificity assay

2.4 重复性试验 选取3个不同浓度的质粒标准品，利用荧光定量PCR方法进行组内组间重复性试验，结果显示，组内变异系数和组间变异系数均小于1.0%（表1）。表明本试验建立的荧光定量PCR方法具有良好的重复性。

表1 qPCR的重复性试验Table 1 The reproducibility test of the qPCR

2.5 临床样品的检测结果 利用建立的荧光定量PCR方法对送检的95份鸭血清进行检测，同时与常规PCR方法进行比较。结果显示，在95份样品中，荧光定量PCR方法检测有12份为DHBV阳性，常规PCR检测有10份DHBV阳性，共同阳性数10份，共同阴性数83份，两者的符合率为97.9%。

2.6 DHBV感染雏鸭的动力学检测 在不同时间点采集感染LQM毒株后的雏鸭血清，利用建立的荧光定量PCR方法对其分别进行检测。结果发现，LQM毒株感染雏鸭11 d时血清中病毒含量达到高峰，随后逐渐下降，到25 d时又出现反弹上升（图5）。

图5 LQM毒株感染动力学曲线Fig.5 Infection kinetics curve of LQM strain

3 讨论

传统的PCR快速诊断方法因无法准确定量使其应用受到限制，而荧光定量PCR方法因具有操作简便、灵敏度高、重复性好、可量化等优点在病毒检测方面得到广泛应用[10-14]。由于DHBV的特殊地位，近年来DHBV的动物感染模型越来越受到关注。为实现DHBV的快速定量检测，本研究根据DHBV C基因的保守区域设计一对特异性引物，建立了DHBV的SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法，旨在为该病的临床检测及流行病学研究提供帮助。

本研究建立的荧光定量PCR方法，扩增结果较为理想，标准曲线呈现良好的线性关系，熔解曲线峰值单一。组内和组间的重复性变异系数均小于1%，表明建立的方法重复性好。建立的荧光定量PCR方法特异性好，仅能特异性地检出DHBV，而不能检出DCV、DHAV-2、DTMUV、NDRV等其他病毒。本研究建立的荧光定量PCR检测方法的灵敏度高于普通PCR方法100倍。

为了将建立的荧光定量PCR方法尽快应用于临床，更好地为临床实践服务，本研究对山东不同地区收集的95份样品进行检测，结果发现，荧光定量PCR与常规PCR方法的符合率高达97.9%，且荧光定量PCR检出率（12.6%）高于普通PCR（10.5%）。荧光定量PCR较普通PCR方法不仅减少了漏检的可能性，同时又缩短了检测时间，提高了检测效率。此外，本研究又对DHBV感染雏鸭的动力学进行了研究，利用建立的方法对感染后不同时间的雏鸭体内病毒含量进行检测。检测结果表明，DHBV感染雏鸭后，第11 d时病毒含量达到高峰，随后逐渐下降，该试验结果为药物有效评价时间点的选择提供了科学的理论依据。

本研究建立的SYBR Green荧光定量PCR检测方法，不仅可实时进行数据分析，还能对检测样品进行病毒定量，为DHBV的早期监测和定期普查提供了有效手段，也为今后开展DHBV的综合防控及HBV药物研发评价奠定了良好基础。