低能量脉冲电磁场对金黄色葡萄球菌生长的影响及其与抗生素的协同抑菌作用

2021-11-04李旭纲陈一心邱旭升

中国医学物理学杂志 2021年10期

李旭纲，陈一心,2，邱旭升,2

1.南京中医药大学中西医结合鼓楼临床医学院，江苏南京210008；2.南京鼓楼医院骨科，江苏南京210008

前言

感染性骨不连一直是骨科临床治疗的棘手问题，其治疗目标是消除感染、促进骨折愈合，手术治疗是目前唯一有效的治疗方法。虽然近年来由于优良的内固定材料及手术方法的改进，感染性骨不连的治疗效果有了很大的改善，但其花费高且术后仍存在感染复发、骨折不愈合的风险［1］。因此，寻找一种无创、经济且有效的治疗方法十分必要。脉冲电磁场（Pulsed Electromagnetic Field, PEMF）用于骨不连的治疗已有40多年，其可以控制破骨细胞的形成，刺激人骨髓基质细胞,促进成骨细胞的增殖,从而加快骨不连愈合［2-4］。如果PEMF 同时具有抑菌或杀菌作用，那便为感染性骨不连的治疗提供新的思路。近年来，应用各种物理磁学抑菌的报道不少，其中包括极低频电磁场、旋转磁场、静磁场等等［5-7］。Del Re等［6］研究发现极低频电磁场的暴露使得大肠杆菌内热休克蛋白增多，从而促使细菌凋亡；Fojt 等［8］认为电磁场可能对细胞膜中离子通道渗透性产生影响，从而影响离子进入细胞的运输，从而导致生物体内的生物变化，另一个可能的影响是由于磁场暴露而形成自由基［9］。而对于低能低强度PEMF 对细菌的作用，尚没有相关报道。因此，本研究选用骨科感染常见致病菌金黄色葡萄球作为研究对象，研究PEMF对金黄色葡萄球菌生长的影响及其与抗生素之间的协同作用。

1 实验材料

1.1 菌种

金黄色葡萄球菌（ATCC 29213），来自南京鼓楼医院检验科。

1.2 培养基

营养肉汤培养基（南京便诊生物科技有限公司）；哥伦比亚血琼脂培养基（江门市凯林贸易有限公司）。

1.3 仪器与设备

骨生长刺激仪（荷兰IMD.B.V 公司，Orthopulse®Bone Growth Stimulator，能产生场强1 Gs、频率15 Hz、脉宽5 μs、脉冲群宽5 ms、脉冲群不应期62 ms的PEMF）；DENSICHECK比浊仪（法国生物梅埃利公司）；DRP-9082型电热恒温培养箱（上海森信实验仪器有限公司）。

2 实验方法

2.1 菌液制配

采用接种环选取单个直径约2 mm的标准金黄色葡萄球菌菌株菌落，使用平板划线接种法接种至新的哥伦比亚血琼脂培养基，置入37 ℃温箱培养24 h。隔天取出血琼脂培养基再次选取单个直径约2 mm菌落比浊至0.5麦氏度（相当于1.0×108个细菌/mL）备用。

2.2 不同作用时长的PEMF 对金黄色葡萄球菌生长的影响

取无菌12 孔细胞培养板，每孔加入2 mL 营养肉汤培养基；将备用菌液稀释104倍后加入培养板，每孔加入500 μL。PEMF 组培养皿置于骨生长刺激仪线圈式换能器中央，开启设备，使之充分暴露于PEMF；对照组培养皿置于骨生长刺激仪线圈式换能器中央，关闭设备。所有培养板均置于37 ℃恒温箱培养，每间隔2 h 取培养液倍比稀释后接种至哥伦比亚血琼脂培养基，37 ℃温箱培养24 h 后计菌落数（Colony Forming Unit, CFU）。分别对2、4、6、8 h 这4 个时间点的细菌数进行计数，每个时间点各组均重复6次。

2.3 PEMF与抗生素对金黄色葡萄球菌的联合影响

实验分4 组，即对照组、PEMF 组、抗生素组、PEMF+抗生素组。将备用菌液稀释至105CFU/mL，头孢呋辛配至0.687 5 μg/mL，取无菌12 孔细胞培养板。对照组与PEMF 组加50 μL 105CFU/mL 菌液、450 μL 生理盐水以及2 mL 营养肉汤培养基；抗生素组和PEMF+抗生素组加50 μL 105CFU/mL 菌液、450 μL 0.687 5 μg/mL 抗生素以及2 mL 营养肉汤培养基；PEMF 组及PEMF+抗生素组培养皿置于骨生长刺激仪线圈式换能器中央，开启设备，使之充分暴露于PEMF；对照组、抗生素组培养皿置于骨生长刺激仪线圈式换能器中央，关闭设备。所有培养板均置于37 ℃恒温箱培养，8 h后取培养液倍比稀释后接种至哥伦比亚血琼脂培养基，37 ℃温箱培养24 h 后计菌落数。每组重复6次。

2.4 统计学分析

采用SPSS 22.0统计学软件对上述计数结果进行分析，先进行方差齐性判断，符合正态分布的测量数据以均数±标准差表示,采用成组样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 不同作用时长的PEMF 对金黄色葡萄球菌生长的影响

2 h与4 h PEMF组与对照组之间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。6 h与8 h的PEMF干预则显著抑制了金黄色葡萄球菌的生长，差异有统计学意义（P<0.05），6 h时PEMF组菌落计数约为对照组的23%（P<0.001）；8 h时PEMF组菌落计数约为对照组的28%（P=0.001）。详见表1、图1。

表1 不同PEMF干预时长下金黄色葡萄球菌的细菌数（±s）Tab.1 Bacterial count of Staphylococcus aureus under different intervention durations of PEMF(Mean±SD)

细菌数=菌落数×倍比稀释数

作用时长/h 对照组PEMF组t值P值2 4 6 8 341±33 2 718±661 49 567±5 462 298 333±61 389 315±11 2 567±448 11 650±4 103 83 000±223 334 1.657 0.490 13.192 6.924 0.158 0.644<0.001 0.001

图1 PEMF不同干预时长哥伦比亚血琼脂板培养图片Fig.1 Columbia blood agar plate culture under different intervention durations of PEMF

3.2 PEMF与抗生素对金黄色葡萄球菌的联合影响

经倍比稀释（104倍），对照组、PEMF组、抗生素组和PEMF+抗生素组菌落计数结果分别为（65.2±11.4）、（21.8±7.9）、（22.8±2.9）、（6.0±2.9）CFU/mL。PEMF组、抗生素组、PEMF+抗生素组菌落计数分别是对照组的32%、34%，10%，都显著少于对照组（P<0.05）；同时PEMF+抗生素组菌落计数显著少于单独的PEMF组和抗生素组（P<0.05）（图2）。

图2 PEMF与抗生素对金黄色葡萄球菌的联合影响（体外干预8 h）Fig.2 Synergistic antibacterial effect of PEMF and antibiotics on Staphylococcus aureus(in vitro intervention for 8 hours)

4 讨论

感染性骨不连涉及感染和骨不连，多由严重开放性骨折所致，感染是骨不连的主要原因。消除感染，促进骨折愈合是感染性骨不连治疗的目标，手术治疗是目前治疗感染性骨不连的唯一手段，但其费用昂贵，且常需二次手术治疗［1］。作为一种被美国FDA批准应用于临床的治疗技术，PEMF拥有无创、温和、经济等优点，是一种很有希望的骨感染辅助治疗方法。

4.1 低能量PEMF的临床应用

能用于临床治疗的PEMF往往是低能低强度的。早在1981年Heckman 等［2］发现PEMF 可有效促进骨折愈合；Garland 等［10］通过对139 名骨不连患者的长期随访发现，经过每天至少3 h的PEMF治疗，患者骨不连愈合率约为80%。林通等［11］发现PEMF 联合双膦酸盐及钙剂治疗老年骨质疏松症在止痛及增加骨密度值方面有更好的疗效。有研究表明PEMF 可通过对一氧化氮信号传导的PEMF 效应来控制伤口中内源性IL-1β 的动力学，从而通过调节机体的抗炎途径来减少术后的疼痛和麻醉药的使用［12-14］；潘云虎等［15］通过对糖尿病大鼠急性下肢缺血模型的实验研究发现PEMF 可通过刺激血管内皮细胞释放FGF-2促进糖尿病大鼠急性下肢缺血的血管新生。Kwan等［16］的一项临床随机对照研究发现PEMF 可能改善微循环，从而促进慢性糖尿病足溃疡的伤口愈合。低能量PEMF 在治疗骨质疏松、促进骨折愈合、减少术后疼痛以及改善微循坏方面均有一定的积极作用。此外，亦有不少动物实验结果表明PEMF有促进神经损伤修复的功能，但缺少相应的临床研究报导支持［17-18］。

4.2 高能量PEMF的杀菌应用

目前关于PEMF 对细菌作用的研究主要集中在污水处理、食品消毒领域，其所采用的PEMF 为高能高强度电磁场，并不能应用于人体。如Piyadasa等［19］研究发现商用水处理器所产生的PEMF 可导致细菌活力和培养能力下降；李梅等［20］发现长时间高强度的PEMF 暴露使细胞表面发生了不可修复的破损现象，造成细菌正常功能的丧失；张咪［21］发现高强度脉冲磁场可有效杀灭食品中的李斯特菌，并认为高强度PEMF 的暴露加快了钙离子的跨膜运动,胞内钙离子浓度的升高导致了李斯特菌的死亡。

4.3 低能量PEMF的杀菌作用

与已有报导的高能量PEMF杀菌报导不同，本研究采用可供临床应用的低能量PEMF，发现低能量的PEMF 也同样具有杀菌作用。研究结果表明2 h和4 h 的PEMF 干预组计数结果无统计学差异，该时期的细菌处于迟缓期，是细菌对新环境的适应过程，代谢活跃但分裂缓慢；而6 h与8 h的PEMF干预则显著抑制了金黄色葡萄球菌的生长，此时期的细菌处于对数生长期，该时期细菌大小、形态、染色、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用敏感［22］。现有研究表明不同电磁场的脉冲个数、持续时间、频率都是可变的，这些因素可能导致微生物失活的不可逆电穿孔机制，如电解和释放几种自由基，从而导致单独或与电场联合杀灭微生物［23］。同样，细菌膜电位也会随着PEMF的干预而发生改变，使细菌的代谢状态发生根本性的生物学变化［24］，这一变化可能促使细菌膜的损伤，影响细菌增殖［25］。此外，本研究还表明PEMF 与抗生素具有协同抗菌作用。Pilla 等［26］研究发现在PEMF作用下，细胞内Ca2+释放，导致Ca2+与钙调蛋白的结合增加以及与新陈代谢、炎症、细胞凋亡等相关的下游信号通路增多。可见，与药物疗法不同，PEMF 干预很可能通过几个生物级联而不是一个狭窄的信号通路发挥作用。我们也因此猜想PEMF 与抗生素之间不仅仅是单方面抑菌作用的叠加，二者之间可能也存在相互的作用。另一方面，有文献报道PEMF的干预可诱导机体产生一氧化氮，一氧化氮是为数不多的已知的气体信号分子之一，具有扩张血管、减轻炎症的作用［27］。由于感染的骨组织血供受到破坏，因此骨组织中抗生素的浓度往往达不到最低杀菌浓度，因此单纯使用抗生素治疗骨感染效果往往不理想［28］，一氧化氮的扩血管作用可改善局部的微循环，从而提高局部抗生素浓度。所以我们猜想在体内，PEMF 与抗生素的协同抑菌作可能优于体外。

本研究也存在一定的局限性。PEMF 疗法影响生物学的生物物理和细胞机制是复杂的，仍需进一步深入研究。此外，本研究仅选取了骨感染中最常见的金黄色葡萄球菌，PEMF 对于骨感染中其它相关细菌是否同样存在抑制作用，值得进一步研究。