张俊英,朱吉风,江建霞,杨立勇,蒋美艳,李延莉,王伟荣,周熙荣

(上海市农业科学院作物育种栽培研究所,上海 201403)

油菜(Brassica napusL.)是我国重要的油料作物,也是产油效率较高的油料作物之一[1-2]。利用杂种优势是提高油菜产量的有效途经,优良的油菜杂种组合,通常能够增产20%—30%[3-4]。现阶段我国油菜杂交种的种植面积已经超过50%,杂种优势在甘蓝型油菜育种中具有重要地位[5]。

不同来源的甘蓝型油菜显性核不育材料的遗传基础存在一定差异。如宜3A及其衍生系是通过2对显性基因Ms与Rf互作控制,其中Ms为显性不育基因,Rf为显性上位基因,能抑制Ms不育基因的表达,从而恢复可育[6-8]。中国发明专利ZL89109310.9公开了利用上述遗传模式设计的甘蓝型油菜核雄性不育三系制种方案,用甘蓝型油菜纯合两型系中的不育株与临保系生产全不育系,全不育系与恢复系生产杂交种。但是,三系杂交制种是一项长期的工程,临保系与恢复系的纯度会在一定程度上影响到所生产杂交种的纯度。遗传分析表明:宜3A衍生系609AB和Rs1046AB中存在一对受复等位基因控制的遗传模型,即Ms是显性雄性的不育位点,Mf是Ms的等位显性抑制位点,ms是正常可育位点,它们的显隐性关系体现为Mf>Ms>ms[9-10]。有研究采用BnMS5来描述该基因,指出Rs1046AB的复等位基因遗传模式如下:BnMS5b为显性不育基因,BnMS5a为恢复基因,能够恢复BnMS5b导致的不育表型,BnMS5c为正常可育基因,它们的显隐性关系为BnMS5a>BnMS5b>BnMS5c[11-13]。

由于显性核不育杂交种都属于临保系,杂交种中可能混杂有恢复系。采用合适的鉴定方法区分杂交种中的临保系和恢复系,有利于杂交种纯度的鉴定。目前,大田形态学标记鉴定和生化标记鉴定是比较传统的杂交种鉴定方法,形态学标记鉴定虽然简单、快速、易于观察,但是易受环境条件和人为因素的影响[14-15]。生化标记鉴定与形态学标记鉴定相比,更为丰富,容易操作,但是多态性位点数目少,标记不具有共显性,这两种方法很难区分亲缘关系较近的杂交种[16-17]。因此,显性核不育杂交种纯度的鉴定已成为育种生产上亟待解决的重要问题[18]。

在分子标记方法快速发展的背景下,对于杂交种及其纯度,采用分子标记方法进行鉴定,相对于传统的鉴定方法有着非常大的优越性。目前,普遍采用的分子标记法有SNP[19]、CAPS[20]、SRAP[21]、SSR[22]、RAPD[23]、AFLP[24]等。SNP分子标记是在SSR标记之后的第三代分子标记,具有数量多、分布广泛、遗传稳定性等特征,受到科研工作者的关注。近年来SNP分子标记被普遍应用于黄瓜[25]、甜瓜[26]、菜豆[27]、甜椒[28-29]等蔬菜品种的分子鉴定。

目前,甘蓝型油菜显性核不育分子标记研究都集中在BnMS5b(不育基因)和BnMS5a(恢复基因)之间,而没有涉及到BnMS5a(恢复基因)和BnMS5c(临保基因)之间,因此恢复系和临保系的鉴别仍依赖传统的测交鉴定法,周期较长。本研究拟开发能有效用于区分恢复系和临保系的分子标记,旨在利用该分子标记鉴定显性核不育油菜杂交种纯度,为油菜杂交种纯度鉴定提供一条简捷有效的途径。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料均由上海市农业科学院提供。其中3008和3012分别为甘蓝型油菜显性核不育临保系和恢复系,与纯合两型系4078AB内可育株配置杂交组合,分别从每个杂交F1代中提取DNA,进行PCR扩增。显性核不育杂交品种‘核杂17号’用于杂交种纯度鉴定。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

通过对甘蓝型油菜A8和A5染色体已知序列片段与显性核不育恢复基因BnMS5a和临保基因BnMS5c序列比对,确定SNP位点,设计SNP扩增引物(图1)。正向引物为SEF:5’-TCAAAGGTTTAAGGCTTTCG-3’,其中,第20位的碱基T为SNP位点。反向引物为SER:5’-TGTAAAGGTTGAGCCTTTTG-3’,其中,第23位的碱基T为SNP位点。利用设计的SNP扩增引物,分别对甘蓝型油菜显性核不育恢复系和临保系材料进行PCR扩增。

图1 SEF和SER引物的设计Fig.1 Design of SEF and SER primers

1.2.2 DNA提取

在甘蓝型油菜恢复系和临保系与纯合两型系杂交后代中各选取18粒种子进行发芽,从‘核杂17号’杂交种中选取96粒种子进行发芽,待生长至子叶期提取DNA。将油菜茎叶组织置于提前灭菌、预冷的2 mL离心管中,采用CTAB法提取植株的基因组DNA。DNA提取完成后,加入一定量TE buffer震荡混匀,利用NanoDrop2000超微量分光光度计(美国赛默飞世尔科技公司)测定DNA的浓度与OD260∕280值,对于DNA质量合格的单株样品,加ddH2O将DNA质量浓度稀释到50 ng∕μL,-20℃保存备用。

1.2.3 PCR分析

以提取的DNA为模板,采用Bio-Rad PTC200梯度PCR仪(美国伯乐公司)进行PCR扩增,反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸1 min,36个循环;72℃终延伸10 min。扩增结束后,取10 uL PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶检测,凝胶检测采用Bio-Rad凝胶成像系统Gel Doc XR+(美国伯乐公司)。

2 结果与分析

2.1 引物扩增结果

利用设计的SNP扩增引物,分别对甘蓝型油菜显性核不育恢复系和临保系材料进行扩增,结果发现:以恢复系DNA为模板扩增,出现1 051 bp和924 bp两条扩增带,以临保系DNA为模板扩增,只有1 051 bp一条扩增带(图2),表明该标记可有效区分甘蓝型油菜显性核不育恢复系和临保系。

图2 引物SEF和SER在恢复系和临保系材料中的扩增结果Fig.2 Amplification results of restorer line and temporary maintainer line by primers SEF and SER

2.2 测交群体验证

以甘蓝型油菜双低纯合两型系4078AB内可育株为母本,分别与临保系3008和恢复系3012配制杂交组合,从每个杂交F1代中选取18粒种子进行发芽,编号后每个单株取幼嫩叶片,提取DNA,进行PCR扩增、电泳分离。结果表明:恢复系3012杂交F1代比临保系3008杂交F1代多出一条924 bp的多态性条带(图3)。次年田间育性调查结果显示:临保系3008杂交F1群体的25个单株全部为不育株,恢复系3012杂交F1群体的42个单株全部为可育株,与利用引物SEF和SER检测结果高度一致。因此,引物SEF和SER可用于鉴定甘蓝型油菜显性核不育恢复系和临保系。

图3 引物SEF和SER在测交群体3008和3012中的扩增结果Fig.3 Amplification results of testcross populations 3008 and 3012 by primers SEF and SER

2.3 杂交种纯度鉴定

以甘蓝型油菜双低纯合两型系4078AB内可育株为母本,‘沪油15’为父本,通过杂交、回交和系谱法选育恢复系;以‘川油17’为母本,双低纯合两型系4120AB内可育株为父本,通过杂交、回交和系谱法选育临保系和纯合两型系。在获得双低显性核不育三系后,以纯合两型系内的不育株为母本、临保系为父本,生产全不育系,然后以其为母本,与恢复系生产’核杂17号’杂交种。由于杂交种F1基因型中同时具有临保系和恢复系基因,扩增结果应有1 051 bp和924 bp两条扩增带,若杂交种中混杂恢复系,扩增结果只有1 051 bp一条扩增带。为检测‘核杂17号’杂交种的纯度,从‘核杂17号’杂交种中选96粒种子发芽,提取DNA,然后采用引物SEF和SER检测。结果表明:其中90株有1 051 bp和924 bp两条扩增带,6株仅有1 051 bp一条扩增带(图4),检测纯度为93.8%,准确率为100%。可见,开发的分子标记可以准确、有效地鉴定甘蓝型油菜‘核杂17号’杂交种的纯度。

图4 引物SEF和SER在‘核杂17号’杂交种中的验证结果Fig.4 Test results of‘Heza 17’hybirds by primers SEF and SER

3 结论与讨论

甘蓝型油菜核不育雄性三系法构建的授粉控制系统,由临保系与纯合型不育系生产全不育系,解决了核雄性不育两系法应用过程中需拔除不育系中一半可育株的问题,提升了制种水平,降低了生产成本[6,9]。目前,作物杂种优势利用普遍应用三系法制种[30-32]。甘蓝型油菜核雄性不育三系杂交系统需要选育纯合两型系、临保系和恢复系,不仅育种周期较长,而且临保系与恢复系的纯度会直接影响到所生产杂交种的纯度。本研究开发能有效用于区分恢复系和临保系的分子标记,旨在利用该分子标记鉴定显性核不育油菜杂交种的纯度,给油菜杂交种的纯度鉴定提供一条比较简捷的途径。

杂交种子的真伪和纯度检验是杂种种子质量检验的重要内容,形态学标记、生化标记和分子标记均能够用于杂交种纯度的鉴定。形态学标记鉴定虽然简单、快速、易于观察,但易受环境条件和人为因素的影响。生化标记鉴定容易操作,但是多态性位点数目少,标记不具有共显性。分子标记种类和数量较多,遍及整个基因组,具有共显性。本研究应用SEF和SER分子标记对甘蓝型油菜显性核不育杂交种‘核杂17号’进行纯度鉴定,出现1 051 bp和924 bp两条扩增带的为‘核杂17号’杂交种,只有1 051 bp一条扩增带的是混杂的恢复系,检测纯度为93.8%,准确率为100%。可见,本研究开发的SNP分子标记可以准确、有效地鉴定甘蓝型油菜‘核杂17号’杂交种的纯度。

本研究通过对甘蓝型油菜A8和A5染色体已知序列片段与显性核不育恢复基因BnMS5a和临保基因BnMS5c序列比对,挖掘SNP位点,设计SNP引物,并结合实验室琼脂糖凝胶电泳的检测方法,建立了一种简便、快速、准确的检测体系,为甘蓝型油菜显性核不育恢复系和临保系的鉴定提供了技术支撑。