冯磊宁， 张波， 金佑熙， 金彪， 金东日*

( 1.延边大学 理学院， 吉林 延吉 133002； 2.吉林烟草工业有限责任公司 延吉卷烟厂， 吉林 延吉 133001；3.延边大学 分析测试中心， 吉林 延吉 133002 )

0 引言

L- 氨基酸是构成人体中某些生物酶和活性蛋白质分子的重要物质，目前已在食品、医药以及化妆品等领域被广泛应用[1].2002年， N.Fujii在动物和人体中发现了D- 氨基酸[2]，随后经其他学者进一步研究发现D- 氨基酸与人体的某些疾病密切相关,如阿尔兹海默症、抑郁症和精神分裂症等[3-6]，但人体过量摄取D- 氨基酸会引发中毒.氨基酸是众多药物合成的中间物质原料[7].在选用氨基酸合成药物时，为使药物形成单一对映体，通常选用D- 氨基酸或L- 氨基酸;然而非天然氨基酸绝大部分都是以外消旋体形式存在的，因此建立一种能够对D/L- 氨基酸进行高效的分离分析方法具有重要意义.

研究表明，高效液相色谱法(HPLC)分离测定氨基酸具有速度快、灵敏度高、选择性好等优点，已成为目前分离分析对映体化合物的主要方法之一[8].HPLC分离对映体化合物的方法可分为直接法(手性流动相法和手性固定相法)和间接法(手性衍生试剂(CDR)法)[9-10]，其中间接法更适合于分离分析氨基酸[11].目前，利用间接法分离分析氨基酸时使用的衍生化试剂主要有N-[1- 氧代 -5-(三苯基膦)戊基]-(R)-1,3- 噻唑烷基 -4-N- 羟基琥珀酰亚胺酯溴盐[12]、(±)-1-(9- 芴基)氯甲酸乙酯[13]、焦谷氨酸丁二酰亚胺酯(l - PGA - OSu)[14]和(S)-2,5- 二氧吡咯烷 -1- 基 -1-(4,6- 二甲氧基 -1,3,5- 三嗪 -2- 基)吡咯烷 -2- 羧酸盐(DMT -(S)- Pro - OSu)[15]等，但这些衍生化试剂都存在反应易生成多级衍生物、反应条件需要密闭避光、衍生化试剂水解产物影响分离、衍生化试剂制备繁琐等问题[16].2021年， Jin等[17]合成了一种手性衍生化试剂(S)-1-(5-(4- 甲基哌嗪 -1- 基)-2,4- 二硝基苯基)吡咯烷 -2- 羧酸(PPZ - Pro)，但研究发现PPZ - Pro与氨基酸进行衍生化反应时，氨基酸之间会缩合生成副产物肽，即PPZ - Pro不适用于氨基酸的衍生化反应；为此，本文在PPZ - Pro基础上设计合成了一种新的衍生化试剂(S)-2,5- 二氧吡咯烷 -1- 基 -1-(5-(4- 甲基哌嗪 -1- 基)-2,4- 二硝基苯基)吡咯烷 -2- 羧酸酯(PPZ - Pro - NHS).PPZ - Pro - NHS可在温和的反应条件下选择性地与氨基酸反应生成氨基酸衍生物.利用HPLC法将PPZ - Pro - NHS应用于19种氨基酸的分离中显示，其可有效实现19种氨基酸对映体的分离.

1 实验部分

1.1 实验仪器

SPD -16高效液相色谱仪，日本岛津制作所；AV Ⅲ - Ascend 500 HD超导傅里叶核磁共振谱仪，布鲁克公司； 1200RRLC - 6410B液相 - 串联四级杆液质仪，安捷伦公司； FD - ID - 50冷冻干燥机，上海比朗仪器制造有限公司； N -100旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司; FD - ID - 50冷冻干燥机，上海比朗仪器制造有限公司； X - 5显微熔点测定仪 - 控温型，北京泰克仪器有限公司.

1.2 实验试剂

乙腈(分析纯)，天津市大茂化学试剂厂；二氯甲烷(分析纯)、甲醇(分析纯)，天津市富宇精细化工有限公司；甲酸(色谱级)、L- 脯氨酸(99.0%)、1- 乙基 -(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(98.0%)、D/L- 缬氨酸(98.0%)、D/L- 苏氨酸(>98.0%)、D/L- 半胱氨酸(97.0%)、D/L- 谷氨酸(>92.0%)、D/L- 苯丙氨酸(>98.0%)、D/L- 丝氨酸(98.0%)、D/L- 丙氨酸(99.0%)、D/L- 天冬氨酸(98.0%)、D/L- 精氨酸(98.0%)、D/L- 组氨酸(98.0%)、D/L- 异亮氨酸(98.0%)、D/L- 赖氨酸(99.0%)、D/L- 脯氨酸(99.0%)、D/L- 甲硫氨酸(99.0%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三乙胺(>99.0%)、N- 羟基琥珀酰亚胺(>98.0%)，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；无水硫酸镁(分析纯)，天津市科密欧化学试剂有限公司； D/L- 酪氨酸(99.0%)，北京伊诺凯科技有限公司； D/L- 谷氨酰胺(>98.0%)，阿达玛斯试剂有限公司； D/L- 亮氨酸(>98.0%)，上海皓鸿生物医药科技有限公司； D/L- 天冬酰胺(98.0%)、D/L- 色氨酸(98.0%)、L- 缬氨酸、L- 苏氨酸、L- 半胱氨酸、L- 酪氨酸、L- 谷氨酸、L- 苯丙氨酸、L- 丝氨酸、L- 丙氨酸、L- 天冬氨酸、L- 谷氨酰胺、L- 精氨酸、L- 组氨酸、L- 异亮氨酸、L- 赖氨酸、L- 天冬酰胺、L- 亮氨酸、L- 色氨酸、L- 脯氨酸、L- 甲硫氨酸，吉尔生化(上海)有限公司；按文献[17]方法制备PPZ - Pro；实验用水为超纯水，由延边大学理学院化学实验楼超纯水制造系统制备.

1.3 PPZ - Pro - NHS的合成及表征

在含有30 mL二氯甲烷的100 mL茄形瓶中分别加入PPZ - Pro (379 mg，1 mmol)、 N- 羟基琥珀酰亚胺(NHS)(0.126 6 g，1.1 mmol)和EDC(0.210 9 g，1.1 mmol)和，超声震荡1 min后在室温下(25 ℃)搅拌反应12 h.反应结束后，用5 mL的超纯水对反应后所得的溶液进行洗涤萃取(萃取3次).收集(含有PPZ - Pro - NHS)二氯甲烷层后向其中加入无水MgSO4，并在4 ℃温度下静置2 h.过滤去除MgSO4，在2～4 ℃的温度下对溶液进行减压浓缩，得到黄色黏液状产物.冷冻干燥该黄色黏液状产物，得到黄色的固体粉末(PPZ - Pro - NHS)161.8 mg，产率为34%.PPZ - Pro - NHS的m.p.为107.2～107.5 ℃，色谱纯度为95.3%.ESI - MS:m/z=477.3 [M+H]+；1H NMR(500 MHz,MeOD) δ 8.54(s,1H), 6.33(s,1H), 5.14(t,J=7.3 Hz,1H), 3.65～3.42(m,2H), 3.32(t,J=4.9 Hz,4H), 2.86(s,4H), 2.71(t,J=3.0 Hz,4H), 2.54(s,3H), 2.35(ddt,J=13.1,9.0,6.8 Hz,1H), 2.26～2.03(m,3H).13C NMR(500 MHz,MeOD) δ 174.82(s), 170.07(d,J=255.4 Hz), 150.40(d,J=57.8 Hz), 146.31(d,J=56.7 Hz), 129.26(s), 106.04(s), 63.62(s), 55.10(d,J=4.9 Hz), 53.06(d,J=19.5 Hz), 50.85(s), 45.27(s), 31.87(s), 26.34(s), 25.92(d,J=42.5 Hz).

1.4 标准溶液的配制

称取47.6 mg(0.1 mmol) PPZ - Pro - NHS置于10 mL的容量瓶中，然后用乙腈将其溶解并定容至10 mL，由此得到10 mmol/L的PPZ - Pro - NHS标准溶液.

分别称取D/L- 亮氨酸、L- 亮氨酸、D/L- 异亮氨酸、L- 异亮氨酸、D/L- 丙氨酸、L- 丙氨酸、D/L- 色氨酸、L- 色氨酸、D/L- 脯氨酸、L- 脯氨酸、D/L- 缬氨酸、L- 缬氨酸、D/L- 甲硫氨酸、L- 甲硫氨酸、D/L- 苯丙氨酸、L- 苯丙氨酸、D/L- 丝氨酸、L- 丝氨酸、D/L- 苏氨酸、L- 苏氨酸、D/L- 谷氨酰胺、L- 谷氨酰胺、D/L- 半胱氨酸、L- 半胱氨酸、D/L- 赖氨酸、L- 赖氨酸、D/L- 精氨酸、L- 精氨酸、D/L- 组氨酸、L- 组氨酸、D/L- 天冬氨酸、L- 天冬氨酸、D/L- 谷氨酸、L- 谷氨酸各0.1 mmol，将其分别转移至10 mL的容量瓶中后用乙腈溶剂(V(水)∶V(乙腈)=7∶3)将其定容至10 mL，由此得到10 mmol/L的上述溶液的标准溶液.

分别称取D/L- 酪氨酸、L- 酪氨酸、D/L- 天冬酰胺和L- 天冬酰胺各0.1 mmol，将其分别转移至100 mL的容量瓶中后用乙腈溶剂(V(水)∶V(乙腈)=7∶3)将其定容至100 mL，由此得到1 mmol/L的上述溶液的标准溶液.

吸取280 μL的三乙胺(TEA)(2 mmol)置于10 mL的容量瓶中，然后用乙腈将其稀释至10 mL，由此得到200 mmol/L的三乙胺溶液.上述所有溶液均在4 ℃下密封保存.

1.5 衍生化反应

分别取100 mmol/L TEA(120 μL)、10 mmol/L PPZ - Pro - NHS(40 μL)和1 mmol/L氨基酸(40 μL)并将其加入到1.5 mL聚丙烯离心管中.用漩涡混合器震荡1 min后将离心管放入到到恒温(25 ℃)金属浴装置内反应40 min.反应结束后，取反应液2 μL进行HPLC - UV检测.

1.6 色谱条件

色谱柱为Mightsil RP - 18 GP (150 mm×4.6 mm， 3 μm)；流动相A为水溶液(含体积分数为0.1%的甲酸)，流动相B为甲醇(含体积分数为0.1%的甲酸)；流速为0.3 mL/min；柱温为25 ℃；UV检测器波长为354 nm；进样量为2 μL.

2 结果与讨论

2.1 PPZ - Pro - NHS的结构认定

在二氯甲烷溶剂中， PPZ - Pro与NHS反应生成PPZ - Pro - NHS.根据反应液中各组分的水溶性(PPZ - Pro、EDC和NHS易溶于水，PPZ - Pro - NHS易溶于二氯甲烷)，以水为萃取剂萃取未反应的PPZ - Pro、NHS和EDC.由此得到的PPZ - Pro - NHS的色谱纯度如图1所示.由图1可以看出，其色谱纯度达到95.3%.利用核磁共振波谱法(1H NMR、13C NMR)和质谱(MS)对其结构进行表征显示，该物质为目标物PPZ - Pro - NHS.

图1 PPZ - Pro - NHS的色谱纯度

2.2 PPZ - Pro - NHS与氨基酸发生衍生化反应的条件

图2为PPZ - Pro - NHS与氨基酸的反应式.由图2可以看出，在碱性介质(TEA)中PPZ - Pro - NHS与氨基酸反应生成的是稳定的衍生物.在TEA介质中，本文以D - Leu和L - Leu作为氨基酸模型，探究反应介质浓度、反应温度和反应时间对该衍生化反应的影响.

图2 PPZ - Pro - NHS与氨基酸的反应

1)反应介质(TEA)的浓度对衍生化反应的影响.在25 ℃下，选取5个不同浓度的TEA溶液(分别为0、50、100、150、200 mmol/L)分别与D - Leu和L - Leu进行衍生化反应(反应时间均为40 min)，其结果如图3所示.由图3可以看出：当TEA浓度小于100 mmol/L时，D - Leu和L - Leu衍生物的峰面积随TEA浓度的增加而增大；当TEA浓度大于100 mmol/L时，各衍生物峰面积基本保持恒定.因此，本文将100 mmol/L TEA溶液作为最佳反应介质.

图3 TEA浓度对衍生化反应的影响

2)反应时间对衍生化反应的影响.在反应温度为25 ℃和反应介质为100 mmoL/L TEA条件下，将D - Leu和L - Leu分别反应10、20、30、40、50、60 min，其结果如图4所示.由图4可以看出，反应时间为40 min时衍生化反应的产率最高，因此本文选定40 min为最佳反应时间.

图4 反应时间对衍生化反应的影响

3)反应温度对衍生化反应的影响.在反应介质为100 mmol/L TEA和反应时间为40 min的条件下，选取不同的反应温度(分别为10、20、30、40、50、60 ℃)进行D - Leu和L - Leu的衍生化反应，结果如图5所示.由图5可以看出，在不同温度下均能够顺利地进行衍生化反应，因此本实验选择常温(25 ℃)作为反应温度.

图5 反应温度对衍生化反应的影响

2.3 HPLC分离D/L - 氨基酸

为分离不同氨基酸，本文使用6种不同的流动相比例(A与B的体积比分别为49∶51、55∶45、58∶42、60∶40、70∶30、75∶25)对19种氨基酸进行了分离.

图6(a)是D/L- 组氨酸衍生物的色谱图.图6(a)中有3个峰，其色谱保留时间分别为5.5、6.1、24.4 min.其中保留时间为5.5 min和6.1 min的峰是D/L- 组氨酸衍生物产生的峰，保留时间为24.4 min的峰是反应后剩余的衍生化试剂PPZ - Pro - NHS产生的峰.为了确认D- 组氨酸和L- 组氨酸的流出顺序，对L- 组氨酸与PPZ - Pro - NHS反应后的产物进行了HPLC分析，结果如图6(b)所示.由图6(b)可以看出， L- 组氨酸在色谱柱上先流出，其分离度(Rs)为1.38.表1为19种氨基酸衍生物的保留时间(tR)、Rs和流动性条件.由表1可知，大部分氨基酸的Rs大于1.5， 其中L- 氨基酸先流出的是Ser、Thr、Glu、Lys、Cys、Gln、Asp和Asn， D- 氨基酸先流出的是Phe、Trp、Leu、Ile、Val、Met、Pro、His、Arg、Tyr和Ala.

图6 组氨酸衍生物的高效液相色谱图

表1 19种氨基酸的保留时间、分离度和流动相条件

表2是PPZ - Pro - NHS和文献[14-15]报道的手性衍生化试剂对19种氨基酸的分离度.由表2可以看出，文献[14-15]采用的色谱柱虽然比本实验所用的色谱柱的柱效更高，但L - PGA - Osu没能分离出Ser、Thr、Glu、Lys、Cvs、Gln、Asp、Asn、His和Arg， DMT -(S)- Pro - Osu没能分离出Ser和Cys.这表明，本文制备的手性衍生化试剂PPZ - Pro - NHS对氨基酸对映体的分离能力优于文献[14-15]报道的衍生化试剂.

表2 不同衍生化试剂对氨基酸对映体的分离度

注: -为未分离出氨基酸对映体.

3 结论

本文利用(S)-1-(5-(4- 甲基哌嗪 -1- 基)-2,4- 二硝基苯基)吡咯烷 -2- 羧酸(PPZ - Pro)和N- 羟基琥珀酰亚胺(NHS)成功地合成了一种新的手性衍生化试剂PPZ - Pro - NHS.PPZ - Pro - NHS可在温和的反应条件下选择性地与氨基酸反应生成氨基酸衍生物.利用反相高效液相色谱仪对PPZ - Pro - NHS与氨基酸反应生成的氨基酸衍生物进行色谱分析显示，19种氨基酸衍生物在常规C18色谱柱上均具有较好的分离度(1.05～6.08)，因此本文合成的PPZ - Pro - NHS在氨基酸对映体和手性药物的分离和分析方面具有较好的应用前景.