宣超莹，段景龙，刘茂军，马玉忠* (.河北农业大学 动物医学院，河北 保定 0700；.江苏省农业科学院，江苏 南京 004)

乳腺上皮细胞是一种具有合成和分泌乳汁功能的特化细胞[1]，是机体黏膜免疫系统的一部分，是抵御病原体的第一道屏障[2]。大量研究表明，微生物感染是乳房炎发生的主要原因，以葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌为主[3-4]。乳房炎会造成乳品质下降，严重影响着养羊业的发展。目前药物治疗乳房炎是普遍使用的方法，但效果不甚理想，通过体外试验进行乳房炎的研究相对较少。本研究旨在获得同一性高、纯度高、活力强的乳腺上皮细胞，并建立乳腺上皮细胞炎性模型，为进行体外研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物2岁左右健康泌乳期绵羊，体质量25～30 kg，来自河北农业大学实验动物中心。在温度16～28℃，相对湿度40%～60%条件下饲养。该研究经河北农业大学动物管理委员会批准。

1.2 主要试剂DMEM/F12、Ⅰ型胶原酶、0.25% Trypsin购自Gibco公司；CCK-8试剂盒购自Solarbio公司；CK-18抗体购自Abcom公司；TLR-4抗体购自Bioss公司。

1.3 乳腺组织的采集和处理无菌条件下采集5 cm×5 cm×5 cm乳房基部组织，用含有青、链霉素的PBS进行清洗，去除结缔组织，并将组织块剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的小块，清洗到没有奶渍和血渍为止。

1.4 组织块法将剪碎的组织块转入6孔板中，于37℃、5% CO2条件下培养6 h，每孔加入2 mL含15% FBS的DMEM/F12继续培养，2～3 d换液1次。

1.5 酶消化组织块法向组织块中加入0.25%Ⅰ型胶原酶，37℃振荡消化1.5 h，1 000 r/min离心5 min，弃上清，转入6孔板中，37℃、5% CO2条件下培养过夜，加入2 mL含15% FBS的DMEM/F12继续培养。

1.6 酶消化法向组织块中加入0.25%的胰酶(Trypsin)于37℃振荡……