赵忆甜，李秀青，王晓帆，高 峰，张坤朋，翁少亭,* (.河南农业大学 动物医学院，河南 郑州 450046；.安阳工学院 生命与食品工程学院，河南 安阳 455000)

CRISPR/Cas9技术是一种相对成熟，并且简便易行的基因组定点编辑技术，是分子生物学研究和改善生物特性的常用技术[1-2]，该技术可用于制备转基因动物[3-4]。ZHOU等[5]利用CRISPR/Cas9技术建立了敲除Park2和Pink1基因的细胞系，并用体细胞核移植的方法培育出了双基因突变猪。HEO等[6]利用CRISPR/Cas9技术将eGFP序列通过同源重组的方法插入到牛多功能干细胞的Nanog基因中，使胚胎能表达出eGFP荧光蛋白。KIMURA等[7]利用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼的基因进行了基因组定点编辑，通过显微注射的方法将外源基因整合到胚胎的Evx2基因和Englb基因中。然而，转基因动物有抗病能力弱、易癌变、繁殖障碍的缺点，不能被畜牧生产广泛应用。因此需要一种既能改变家畜成体生产性能，又不影响家畜稳定遗传的方法推进畜牧业产能的提升。利用CRISPR/Cas9技术对组织的基因组进行定点编辑是理想的方法，但是，在组织内进行基因组编辑受到多种因素的影响，包括载体的选择、Cas9蛋白的编辑效率以及内部环境的影响等。CRISPR/Cas9的体内表达是通过流体动力学传递或病毒转导实现的，其中病毒转导常用腺病毒(Ad)或腺相关病毒(AAV)载体。以AAV作为Cas9的载体是一种很有潜力的基因组定点编辑工具[8]。CRUDELE等[9]利用该技术对遗传性肌营养不良疾病的特定肌肉区域进行了基因编辑，改善了肌肉萎缩症状。然而，许多CRISPR/Cas9相关元件太大，超过AAV的容量限制(包括两个ITR，约4.85 kb)。……