曾婷婷，谢丽基，谢芝勋，罗思思，李 孟，黄娇玲，张民秀，张艳芳，范 晴，邓显文 (广西壮族自治区兽医研究所，广西 南宁 530001)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由中等毒力或强毒力的新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的高传染性、高致病性和高致死性的传染病。NDV可以感染超过250种禽类和鸟类[1]，根据全基因组遗传进化分析，NDV被划分为ClassⅠ和ClassⅡ两大分支[2]，目前引起发病的NDV绝大多数是ClassⅡNDV。世界动物卫生组织(OIE)根据NDV的3个致病指数，将NDV划分为速发型、中发型和缓发型毒株[3]，即通俗称的强毒、中等毒和弱毒。决定NDV毒力的主要基础是F蛋白的前体F0蛋白能否被宿主蛋白酶裂解，所以F0蛋白裂解位点所对应的核苷酸序列可作为判断NDV毒力的分子标志[3]。目前，已有研究者建立了针对这个位点的不同的分子生物学鉴别检测方法，如RT-PCR[4]及qRT-PCR方法[5]等。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是NOTOMI等[6]发明的等温扩增技术，具有使用仪器简单、检测结果可视化、反应时间短等优势，在各种疾病检测中得到了广泛的应用。本研究将分子信标引入LAMP反应体系，设计了一套能同时扩增ClassⅡNDV不同基因型F基因的LAMP引物，同时设计2条针对不同毒力NDV F0蛋白裂解位点对应核苷酸序列的分子信标，建立了一套能够通过反应后观测荧光信号判断NDV毒力的双重荧光RT-LAMP检测方法。

1 材料与方法

1.1 病毒株本实验使用病毒株均为本实验室保存，具体见表1。

表1 毒株信息

1.2 主要试剂与仪器EasyPure®Viral DNA/RNA Kit，EasyPure®Quick Gel Extraction Kit，EasyScript®One-Step RT-PCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司；RT-LAMP试剂盒WarmStart®LAMP Kit (DNA & RNA) 购自美国New England Biolabs(NEB)公司；体外转录试剂盒RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems购自美国 Promega公司；超微量分光光度计NanoDrop 2000购自美国Thermo Fisher Scientific公司；……