任晴雯，安立昆，姚有华，姚晓华，刘凡语，吴昆仑

(1.青海大学，西宁 810016；2.青海省农林科学院，西宁 810016；3.青海省青稞遗传育种重点实验室/国家麦类改良中心青海青稞分中心，西宁 810016)

青稞(HordeumvulgareL.var.nudumHook.f.)，是青藏高原地区最重要的粮食和饲料作物之一，是高原农业文明的象征。长期的进化和人工培育使得青稞适应了高原地区高寒、贫瘠、干旱、强紫外线等极端恶劣气候，是青藏高原海拔2800m以上地区唯一能正常生长的粮食作物，青稞的生产直接影响着藏区的粮食安全和经济发展[1-2]。磷元素是作物正常生长发育不可缺少的三大营养元素之一，对于作物生长发育、抗性、产量、品质都有直接影响。土壤中的磷易与阳离子螯合形成难溶化合物，虽然很多土壤中富含磷元素，但是能够供植物吸收利用的土壤有效磷的含量很低，这使得磷肥的利用效率远低于氮和钾[3-4]。在中国大多数耕地中都普遍存在磷元素缺乏和作物磷利用率低的问题，而长期过量施用磷肥会引起更严重的农业生态灾难[5]。研究磷高效利用基因，提高作物对土壤中磷的利用率，是实现生态农业可持续发展的重要途径之一[6]。青稞的主要栽培地区大多地处高原，生态环境极为敏感脆弱，对过量化肥施用引起的生态环境问题更为敏感，尤其是青藏高原地处三江源头在全国具有特殊的生态地位，青藏高原的农业生态环境保护直接关系到青藏高原地区的经济发展。近年来青藏高原地区开展以生态文明统领经济发展，农业生产实施化肥减量增效战略。克隆和研究青稞磷高效利用相关基因对研究青稞耐低磷机制以及利用分子育种技术培育耐低磷青稞品种具有重要意义，有助于减少化肥的施用，降低农业生产成本，保护生态环境。对促进青藏高原地区乃至全国青稞栽培区域的生态农业发展具有重要意义。

植物对磷的吸收和转运主要依靠磷转运蛋白来完成，植物中磷转运蛋白分为高亲和磷转运蛋白和低亲和磷转运蛋白，高亲和磷转运蛋白受低磷快速诱导特异性表达，低亲和磷转运蛋白是组成性表达[7-9]。目前植物磷转运蛋白研究主要集中在PHT1、PHT2、PHT3、PHO1和PHO2五大家族。植物体中磷从地下往地上的长距离运输主要依赖PHO1家族磷转运蛋白，PHO1是第一个被鉴定出能够将磷从植物器官流出的磷转运蛋白，PHO1家族转运蛋白主要在根中柱细胞中表达，负责将磷装载到木质部，还可以吸收磷进入到细胞，在植物磷运输和磷动态平衡过程中发挥着极为重要的作用[10-13]。Ma等[14]对水稻OsPHO1;2进行研究，发现OsPHO1;2介导苗期根和茎组织之间的磷转运，同时具有内流和外排活性，并以外排活性为主，OsPHO1;2并不参与细胞内的磷转运过程，而是作为外运蛋白将磷从细胞中释放出来。目前，关于植物磷转运蛋白PHO1家族的研究主要集中在拟南芥和水稻等模式植物中，其他植物中的研究报道较少，尤其是青稞中尚未见研究报道。本研究从青稞‘昆仑14’中克隆得到磷转运蛋白基因HvnPHO1;2，对其基因结构和启动子区域元件、该基因编码蛋白的蛋白理化性质、跨膜结构、信号肽、二、三级结构进行了预测分析，对其他植物中的同源蛋白序列进行序列比对并构建系统进化树进行分析。此外还对其亚细胞定位和表达模式进行了分析。关于青稞中磷吸收利用相关基因研究报道极少，克隆和研究青稞磷高效吸收利用相关基因对研究青稞耐低磷机制以及利用分子育种技术培育耐低磷青稞品种具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

青稞品种‘昆仑14’和本氏烟草(Nicotianabenthamiana)由青海省青稞遗传育种重点实验室保存。DNA提取采用天根生化科技有限公司植物基因组DNA提取试剂盒DP305。KOD-FX高保真PCR酶和荧光定量PCR试剂盒TOYOBO THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(QPS-201)购自东洋纺(上海)生物科技有限公司。TransZol Up Plus RNA提取试剂盒和PCR产物连接及cDNA合成试剂盒EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(AE301-03)购自全式金生物技术有限公司。限制性内切酶XbaⅠ和KpnⅠ购自NEB公司。大肠杆菌感受态为自制DH5α感受态。引物合成和测序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1 青稞DNA提取和cDNA合成 青稞品种‘昆仑14’种植于青海大学农林科学院实验温室内。待其长至3叶期时，摘取叶片提取DNA和RNA。参照天根生化科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒DP305说明书提取青稞叶片基因组DNA，参照全式金生物技术有限公司TransZol Up Plus RNA提取试剂盒提取的RNA，并参照EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix cDNA合成试剂盒合成 cDNA，所有样品放于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 引物设计 PCR引物参照表1。

表1 引物序列Table 1 The primers

1.2.3 青稞HvnPHO1;2基因克隆 在植物基因组数据库Gramene(http://www.gramene.org/)中搜索获得大麦HvPHO1;2(HORVU6Hr1G089130.12)基因信息，并根据HvPHO1;2基因和启动子区域序列设计引物，采用KOD-FX高保真PCR酶从青稞品种‘昆仑14’ cDNA中扩增出青稞HvnPHO1;2基因片段，从DNA中扩增出启动子区域片段。扩增程序为： 10× PCR缓冲液12.5 μL dNTP Mixture(25 mmol/L) 5.0 μL，正反向引物(20 μmol/L)各 1 μL，模板DNA 1.0 μL，KOD-FX酶(5 U/μL)0.5 μL， ddH2O 4.0 μL，共25 μL。以提取的青稞DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应程序为：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，68 ℃ 2.5 min，35个循环；4 ℃保存。反应完毕，取5 μL PCR产物在含EB的10 g/L琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下检测。将PCR产物与pEASY-Blunt Cloning载体混合参照说明书进行连接并转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并送测序。

1.2.4 青稞HvnPHO1;2基因生物信息学分析 在植物基因组数据库Gramene(http://www.gramene.org/)中获得基因结构信息。利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析启动子元件。利用蛋白理化性质分析网站(https://web.expasy.org/protparam/)分析理化性质。利用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析跨膜结构。利用SignalP(http://www.Cbs.Dtu.Dk /services /SignalP/)分析蛋白信号肽。利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)中分析蛋白二级结构。利用Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org/)进行同源建模生成三级结构预测图。在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索得到拟南芥(Arabidopsisthaliana)AtPHO1;2、大豆(Glycinemax(Linn.) Merr.)GmPHO1;2、水稻(OryzasativaL.)OsPHO1;2、玉米(ZeamaysL.)ZmPHO1;2、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)BdPHO1;2、番茄(Solanumlycopersicum)SlPHO1;2、甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)的蛋白序列，采用DNAMAN7.0与大麦和青稞HvnPHO1;2蛋白序列进行比对，并根据NCBI提供的蛋白信息分析保守结构域和关键氨基酸位点。在植物基因组数据库Gramene(http://www.gramene.org/)和NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索得到二型花(Dichantheliumoligosanthes)DoPHO1;2、OsPHO1;2、萝卜(Raphanussativus)RsPHO1;2、醉蝶花(Tarenayahassleriana)ThPHO1;2、橡胶树(Heveabrasiliensis)HbPHO1;2、木薯(Manihotesculenta)MePHO1;2、麻疯树(Jatrophacurcas)JcPHO1;2、蓖麻(Ricinuscommunis)RcPHO1;2、毛果杨(Populustrichocarpa)PtPHO1;2、可可树(Theobromacacao)TcPHO1;2、榴莲(Duriozibethinus)DzPHO1;2、棉花(Gossypiumhirsutum)GhPHO1;2、木槿(Hibiscussyriacus)HsPHO1;2、茶(Camelliasinensis)CsPHO1;2、芝麻(Sesamumindicum)SiPHO1;2、烟草(NicotianatabacumL.)NtPHO1;2、野草莓(Fragariavescasubsp.vesca)FvPHO1;2、桃(Prunuspersica)PpPHO1;2、狭叶羽扇豆(Lupinusangustifolius)LaPHO1;2、花生(Arachisipaensis)AiPHO1;2、木豆(Cajanuscajan)CcPHO1;2、白菜型油菜(Brassicarapa)BrPHO1;2、芦笋(Asparagusofficinalis)AoPHO1;2、小兰屿蝴蝶兰(Phalaenopsisequestris)PePHO1;2、油棕(Elaeisguineensis)EgPHO1;2、海枣(Phoenixdactylifera)PdPHO1;2、山羊草(Aegilopstauschiisubsp.tauschii)AtsPHO1;2、羊黍(Panicumhallii)PhPHO1;2、高粱(Sorghumbicolor)SbPHO1;2以及HvnPHO1;2的蛋白序列输入MEGA7中以最大似然法构建系统进化树。

1.2.5 亚细胞定位表达载体构建 根据HvnPHO1;2cDNA序列以及pBI221-GFP载体多克隆位点设计引物(表1)，并在其正向和反向引物上分别加上XbaⅠ和KpnⅠ酶切位点和保护碱基，使用高保真酶KOD-FX扩增该片段，反应程序为：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s， 56 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min 30 s，35个循环；4 ℃保存。反应完毕，取 5 μL PCR产物在含EB的10 g/L琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下检测。用XbaⅠ和KpnI对pBI221-GFP载体及PCR产物进行双酶切，37 ℃酶切5 h后回收片段后进行混合，采用T4连接酶连接后转化大肠杆菌感受态中。选取阳性克隆进行测序。将构建好的pBI221-HvPHO1;2::GFP载体通过冻融法转化入农杆菌GV3101中，将制备好的菌液注射入烟草叶片中。放入温度25 ℃，相对湿度60%，12 h光周期中培养2～3 d。将叶片剪成1 cm2大小，置于激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

1.2.6 青稞HvnPHO1;2基因表达模式分析 将青稞‘昆仑14’种植于实验温室中，于灌浆期时，分别取旗叶、根、茎秆、籽粒、分蘖节样品，立即放于液氮中，-80 ℃保存以备用。每个样品至少选取3个生物学重复，分析不同部位中的HvnPHO1;2的表达情况。选取饱满的青稞‘昆仑14’种子用84消毒液浸泡6 min后用清水冲洗5次，将种子放在铺有滤纸的培养皿中室温下进行萌发，5 d后选取长势一致的幼苗固定于泡沫板中，每个泡沫板25株幼苗，放于黑色塑料盒(400 mm × 300 mm × 120 mm)中采用改良Hoagland’s培养液(1 mmol/L KH2PO4)进行培养，每个塑料盒5 L培养液。用空气泵24 h向培养液中通入空气，每3 d更换一次培养液，每天用1 mol/L KOH溶液稳定pH为7.0。当青稞生长至5叶期时，分别进行低磷胁迫、NaCl胁迫、ABA、MeJA、生长素NAA处理。将培养液换为低磷改良Hoagland’s培养液(10 μmol/L KH2PO4)进行低磷处理。采用含有200 mmol/L NaCl的改良Hoagland’s培养液对青稞幼苗进行盐胁迫处理。分别配制100 mol/L的ABA、MeJA、NAA溶液，每种溶液配置200 mL并加入 0.1% Tween-20对青稞植株叶片进行均匀喷洒，对照组仅喷洒200 mL加有0.1% Tween-20的纯水。以上处理都于0 h(对照)、6、12、24、48、 96 h时取叶片或根并立即放于液氮中，-80 ℃保存以备用。每个样品至少选取3个生物学重复，分析HvnPHO1;2在不同处理下的表达模式。

采用全式金TransZol Up Plus RNA提取试剂盒，提取青稞叶、根、茎秆、分蘖节样品的总RNA。青稞籽粒采用天根生化科技有限公司多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(DP441)提取总RNA。根据HvnPHO1;2基因的cDNA序列设计实时荧光定量PCR引物(表1)，内参基因为18SrRNA。以500 ng/μL cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR分析。反应体系为：正反向引物各1.0 μL，cDNA 2.0 μL，THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix 10 μL，ddH2O 6.0 μL，共20 μL。每个反应3次重复，Ct值取平均值。根据2-△△Ct算法计算基因的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 青稞 HvnPHO1;2基因和启动子区域序列克隆

通过PCR分别扩增出片段大小为2 400 bp的基因片段和2 001 bp的启动子区域片段(图1)。将扩增得到的片段连接入载体pEASY-Blunt Cloning载体中采用M13引物进行测序获得青稞HvnPHO1;2基因和启动子区域片段。

2.2 青稞 HvnPHO1;2生物信息学分析

2.2.1 基因结构和启动子功能元件预测分析 根据植物基因组数据库Gramene(http://ensembl.gramene.org/genome_browser/index.html)中获得的HvnPHO1;2(HORVU6Hr1G089130.12)的基因结构，HvnPHO1;2所对应的转录本含有15个外显子和14个内含子(图2)。将克隆得到的HvnPHO1;2基因启动子区域序列输入启动子元件分析网站PlantCARE中进行分析发现除了启动子核心元件以外还具有大量关于植物激素、脱落酸、茉莉酸顺式作用元件，此外还具有低温响应元件和种子特异性调控顺式作用元件(表2)。

表2 青稞 HvnPHO1;2启动子区域元件分析Table 2 Structure of cis-acting elements in promoter region of HvnPHO1;2 gene

2.2.2 青稞HvnPHO1;2蛋白理化性质和结构分析 通过在线软件ProtParam分析青稞HvnPHO1;2蛋白的理化性质(表3)。该蛋白由799个氨基酸组成，分子质量为90 365.42 u，总原子数为12 735，亲水系数为-0.069属于亲水蛋白，理论等电点为9.33，不稳定指数为40.18属于不

表3 HvnPHO1;2蛋白质理化性质分析Table 3 Physical and chemical properties of HvnPHO1;2 protein

稳定蛋白，脂溶性指数为87.08。通过在线软件TMHMM Server v.2.0网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)对HvnPHO1;2蛋白跨膜结构域进行分析发现HvnPHO1;2蛋白具有6个跨膜结构(图3)。采用在线软件SignalP-5.0(http://www.Cbs.Dtu.Dk/services/SignalP/)对HvnPHO1;2进行分析发现HvnPHO1;2不具有信号肽(图4)。采用在线软件SOPMA分析HvnPHO1;2蛋白二级结构发现该蛋白的α螺旋(Alpha helix)、延长链(Extended strand)、β转角(Beta turn)、无规则卷曲(Random coil)分别占氨基酸总数的55.94%、8.14%、 3.13%、32.79%(图5)。采用在线软件Swiss-Model(https://swissmodel.expasy.org/)对青稞HvnPHO1;2蛋白进行同源建模生成三级结构模型，其结构和二级结构预测结果基本一致 (图6)。

2.2.3 HvnPHO1;2蛋白氨基酸序列对比和同源进化分析 采用DNAMAN7.0将青稞HvnPHO1;2和大麦HvPHO1;2的蛋白序列与拟南芥AtPHO1;2、大豆GmPHO1;2、二穗短柄草BdPHO1;2、番茄SlPHO1;2、烟草NtPHO1;2、油菜BnPHO1;2、水稻OsPHO1;2、玉米ZmPHO1;2进行蛋白序列对比。结果表明，蛋白都具有SPX和EXS结构域，大麦HvPHO1;2和青稞HvnPHO1;2的蛋白序列完全一致(图7)。将青稞HvnPHO1;2与36种物种同源蛋白序列输入MEGA7中构建系统进化树，发现进化树主要分为单子叶植物和双子叶植物两个分支，大麦HvPHO1;2和青稞HvnPHO1;2与山羊草AtsPHO1;2亲缘关系最近(图8)。

2.3 HvnPHO1;2亚细胞定位研究

将带有载体pBI221- HvPHO1;2::GFP的农杆菌GV3101注射入烟草叶片中，对Hvn PHO1;2进行亚细胞定位研究发现绿色荧光信号分布于细胞膜上，说明HvnPHO1;2定位于细胞膜上(图9)。

2.4 HvnPHO1;2表达模式分析

采用qPCR分析HvnPHO1;2的表达模式发现，在不同的器官中茎秆和籽粒中的表达量较高，其次是分蘖节和根(图10-A)。低磷胁迫处理会明显诱导青稞叶片和根中的HvnPHO1;2表达，叶片和根中HvnPHO1;2表达在第24 h后明显增高，在低磷处理48 h之后叶片和根中的HvnPHO1;2的表达趋于稳定(图10-B)。NaCl处理也能诱导青稞叶片和根中HvnPHO1;2的表达(图10-C)。不同植物激素处理发现脱落酸ABA、茉莉甲酯MeJA能够诱导青稞叶片中HvnPHO1;2的表达，而生长素NAA处理下青稞叶片中HvnPHO1;2的表达并没有出现明显变化(图10-D～F)。

3 讨 论

PHO1磷转运体家族是植物体内多种磷转运蛋白家族中的重要成员，PHO1家族在将吸收入植物体内的磷远程转运至地上部分的过程中发挥着重要的作用，其功能缺失后会导致植物体内磷向植株顶端转运受到抑制，PHO1家族不仅存在于被子植物中，也广泛分布于苔藓、蕨类、裸子植物等其他高等植物中[15]。PHO1基因是从一个地上部分磷积累变少的拟南芥突变体中首次发现的，该突变体可以正常吸收磷进入根部，但磷通过维管束向芽转移的过程受到抑制，正常供磷条件下根部对磷的吸收与野生型差异不大，在低磷培养条件下突变体嫩枝上的磷含量减少到野生型水平的3%～10%[16]。Rouached等[17]对拟南芥PHO1;2、PHO1;4基因功能缺失突变体pho1;2、pho1;4进行研究发现该拟南芥中磷元素无法被运转到植株顶端，地上梢部叶片严重缺磷，但临近根部的组织依然正常，将水稻OsPHO1;2转入pho1;2、pho1;4突变体中发现拟南芥恢复了正常。蒋亭亭[18]对水稻OsPHO1功能缺失突变体ospho1进行研究发现ospho1对磷的吸收能力降低，磷由地下部分向上运输能力受阻，ospho1生长缓慢，植株矮小，地上部表现缺磷症状，与野生型相比ospho1的株高、分蘖、穗长、结实率与千粒质量都明显降低，但突变体种子长度增加，宽度降低。目前，关于植物磷酸转运蛋白PHO1家族的研究主要集中在拟南芥和水稻等模式植物中，其他植物中的研究报道较少，尤其是青稞中尚未见研究报道。

本研究克隆了青稞磷转运蛋白HvnPHO1;2基因和启动子区域序列，对其基因和蛋白进行了生物信息学分析，并对其亚细胞定位和表达模式进行了研究。发现青稞HvnPHO1;2基因具有15个外显子和14个内含子HvnPHO1;2为亲水性不稳定蛋白，具有6个跨膜结构，不具有信号肽。启动子元件分析发现HvnPHO1;2启动子区域除了具有大量的TATA-box和CAAT-box启动子核心元件以外还具有大量的植物激素相关顺式作用元件，其中有6个脱落酸ABA和10个茉莉酸JA相关的顺式作用元件，说明HvnPHO1;2受脱落酸和茉莉酸的调控。一些研究也表明PHO1家族中一些成员会受脱落酸和茉莉酸强烈诱导表达，尤其是脱落酸引起的气孔关闭需要保卫细胞中特异表达PHO1，其具体原因和机制尚不清楚[19-20]。蛋白序列比对发现青稞HvnPHO1;2和大麦HvPHO1;2蛋白序列完全一致，并且都具有N端的SPX结构域和C端EXS的结构域，这两个结构域是PHO1类蛋白的典型结构域。通过与其他物种的同源蛋白序列进行比对并构建系统进化树发现青稞HvnPHO1;2和大麦HvPHO1;2与山羊草AtsPHO1;2亲缘关系最近。本研究进行亚细胞定位发现HvnPHO1;2定位于细胞膜上。叶思诚[9]对不同磷水平下两个油茶无性系根系转录组分析从中筛选并克隆了PHO1基因家族中的CoPHO1-3进行亚细胞定位预测分析发现很可能定位在细胞膜上。Ma等[14]对水稻OsPHO1;2进行亚细胞定位研究也发现OsPHO1;2定位于细胞膜上。有研究表明同一植物中PHO1基因家族不同成员的表达模式差异极大[21]。本研究对HvnPHO1;2的表达模式进行分析发现HvnPHO1;2在青稞茎秆和籽粒中表达量较高，并且受MeJA、ABA的诱导表达，这与其启动子区域预测到有种子特异性调控和大量MeJA、ABA相关的顺式作用元件结果一致，虽然其启动子区域也预测到有1个生长素顺式作用元件，但NAA处理并没有诱导其表达。此外低磷和NaCl胁迫处理也可以明显诱导HvnPHO1;2在青稞叶片和根中表达。崔维旭[22]克隆了森林草莓FvPHO1;H9并对其功能和表达模式进行研究发现FvPHO1;H9在花和叶柄中表达量高，而在幼叶、老叶、根中表达量低，在果实发育的过程中果实内FvPHO1;H9基因表达量不断升高，低磷、干旱、低温胁迫可以显著诱导森林草莓根和叶中FvPHO1;H9表达，而赤霉素GA3和生长素IBA诱导效果不显著，对FvPHO1;H9的RNAi干扰草莓株系进一步研究发现FvPHO1;H9表达量下降的株系长势明显不及野生型，根、叶片、果实中的磷含量积累明显下降。何玲莉[23]克隆了大豆14个GmPHO1基因家族成员GmPHO1H01～GmPHO1H14，对其分子进化和功能分化进行研究发现，这些基因分布于7条染色体上，内含子数目为12～15个不等，GmPHO1H01～GmPHO1H08在营养和生殖器官中均有表达，GmPHOIH02在种子发育过程中其表达量较高，认为GmPHOIH02可能参与大豆种子发育过程，GmPHO1H09～GmPHO1H14主要在营养器官中表达，生殖器官中的表达量较低或不表达，其中GmPHO1H07受干旱和盐胁迫诱导表达，GmPHO1H012和GmPHO1H014表达受干旱胁迫抑制，而盐胁迫可以诱导其表达，认为GmPHO1H07、GmPHO1H012、GmPHO1H014可能参与调控应对胁迫反应。综合上述研究结果，PHO1家族磷转运蛋白在植物体内不仅仅参与磷元素的转运，很可能具有其他的生理功能，本试验克隆了青稞HvnPHO1;2基因和其启动子区域序列并进行了初步研究，为青稞中磷高效吸收转运相关基因研究提供了一定参考，关于其在青稞中的具体功能，有待于进一步研究。