赵烨婧，彭红玉，刘建勋，柳景华

冠状动脉粥样硬化性心脏病归属于中医学“胸痹”“心痛病”范畴，其中急性冠脉综合征为凶险和严重的一种类型[1]。心气充沛、气血调和，才能保证心脏正常的生理功能。若心气亏虚或瘀滞，则血行无力，乃致血停成瘀，强调胸痹心痛的病机关键在于血瘀，而气滞血瘀证和气虚血瘀证是气血失和的两种重要表现类型，均是形成冠心病血瘀证候的重要病理生理机制[2-4]。两者表现为相同血瘀证的客观征象同时，微观层面是否具有各自独特的病理生理变化或分子调控机制尚不明确。随着基因表达芯片技术及生物信息学方法的蓬勃发展，越来越多的基础研究致力于探讨中医宏观证候与微观物质基础、分子机制调控之间的相互联系，微小RNAs(microRNAs，miRNAs)的发现和不断发展为丰富现代中医理论提供了新的切入点。相关研究证实，miRNAs与冠心病关系密切，且在疾病的发生发展过程中发挥着重要作用，且miRNAs的表达具有时序性、特异性，这种表达特点与中医“证”反映的机体病理状态吻合，miRNAs表达异常引起相应基因网络调控紊乱是导致疾病发生的重要内在原因[5-6]。因此，本研究以急性冠脉综合征气滞血瘀证、气虚血瘀证病人为研究对象，利用基因表达芯片技术及生物信息学方法，对气滞血瘀证和气虚血瘀证病人循环miRNAs表达谱变化进行分析，并对差异miRNAs进行靶基因预测及功能分析，旨在从微观层面进一步阐明血瘀证不同亚型的病理生理机制，为冠心病辨证分型提供客观依据和理论支持。

1 资料与方法

1.1 研究对象 本研究依托于973计划(No.2015CB554404)，研究方案经医院伦理委员会批准(No.2015031)且所有病人均自愿参与本研究并签署知情同意书。选取2017年4月—2018年7月于首都医科大学附属北京安贞医院拟行经皮冠状动脉介入(PCI)治疗的急性冠脉综合征病人10例，其中气滞血瘀证5例，气虚血瘀证5例。

1.2 纳入及排除标准

1.2.1 纳入标准 年龄18～80岁；符合急性冠脉综合征诊断标准；中医辨证为气滞血瘀证或气虚血瘀证；所有病人均签署知情同意书；临床资料及相关数据完整。

1.2.2 排除标准 严重肾功能不全，血清肌酐男性>220 μmol/L，女性>175 μmol/L；患有明显的肝脏疾病或转氨酶高于正常上限3倍；严重心、肺功能不全；未控制的Ⅲ级高血压病人[治疗后收缩压>160 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，舒张压>100 mmHg]；合并急性脑血管疾病或严重瓣膜性心脏病；严重造血系统疾病；严重精神类疾病病人；妊娠或准备妊娠妇女，哺乳期妇女；恶性肿瘤或病人预期寿命<3年；病人拒绝签署知情同意书，或估计依从性较差、随访可能性差；近3个月内参加过或正在参加其他临床试验。

1.3 诊断标准

1.3.1 急性冠脉综合征诊断标准 参照2013年美国心脏病学会(ACCF)/美国心脏学会(AHA)ST段抬高型心肌梗死管理指南[7]和2012年中华医学会心血管病学分会制定的非ST段抬高型急性冠脉综合征诊治指南[8]。

1.3.2 中医辨证标准 参照1990年中国中西医结合学会心血管病专业委员会制定的冠心病中医辨证标准[9]。

1.4 研究方法

1.4.1 一般资料 收集并详细记录入选病人临床资料，包括性别、身高、体重、血压、心率及是否合并高血压、糖尿病、高脂血症、肾功能不全、吸烟史等既往史。

1.4.2 血液标本采集 于病人入院后次日清晨抽取空腹静脉血6～8 mL，血液样本待自然凝固30 min后，以3 000 r/min离心10 min，留取上层血清，冻存-80 ℃低温冰箱备用。

1.4.3 miRNAs提取与质检 使用mirvannatm PARISTM试剂盒从血浆中提取总RNA，利用NanoDrop ND-2000(Thermo Scientific)定量并经Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)检测RNA完整性。

1.4.4 miRNAs芯片高通量筛选 RNA质检合格后，将提取血清总RNA进行靶标制备，总RNA逆转录为双链cDNA，再进一步合成用Cyanine-3-CTP(Cy3)标记的cRNA。标记好的cRNA与芯片杂交，洗脱后利用Agilent Scanner G2505C(Agilent Technologies)扫描得到原始图像。采用Feature Extraction 软件(version 10.7.1.1，Agilent Technologies)处理原始图像提取原始数据，进一步对原始数据进行quantile标准化及数据过滤。用于比较的每组样本中至少1组100%标记为Detected的探针留下进行后续分析。利用t检验的P值和Fold-change法筛选差异表达的miRNAs，筛选的标准为上调或者下调倍数变化值≥2.0且P值≤0.05。

1.4.5 差异miRNAs靶基因预测 通过miRDB和miRWalk两个数据库预测差异表达miRNAs的靶基因。miRWalk是基于软件学习的miRNAs靶基因预测算法TarPmiR预测miRNAs-mRNAs的靶基因关系对；miRDB是基于机器学习的miRNAs靶基因预测算法miRTarg内皮素预测miRNAs可能的靶基因，最终获取数据库的交集基因进行分析。

1.4.6 基因功能富集与信号通路分析 利用The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery(DAVID)平台(https://david.ncifcrf.gov/)中的基因本体(Gene Ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)数据库对差异表达基因进行功能富集与信号通路分析，判定差异miRNAs影响的细胞分子通路或生物学功能。

2 结 果

2.1 两组临床资料比较 两组年龄、性别比例、体质指数、血压、既往病史、吸烟史及Gensini评分比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。详见表1。

表1 两组临床资料比较

2.2 气滞血瘀证组和气虚血瘀证组差异性表达的miRNAs 气滞血瘀证组和气虚血瘀证组血清miRNAs表达微阵列经扫描和数据分析，以相对表达水平差异倍数≥ 2.0且P值≤0.05作为筛选标准，共筛选出13个差异表达的miRNAs，包括11个表达上调的miRNAs和2个表达下调的miRNAs，火山图详见图1。上调的miRNAs包括miR-7111-3p、miR-4515、miR-4436b-5p、miR-6743-3p、miR-4664-3p、miR-7974、miR-4646-3p、miR-6760-3p、miR-6507-3p、miR-6731-3p、miR-7114-3p和下调的miRNAs包括miR-3656、miR-4442，聚类图详见图2。

图1 气滞血瘀证组和气虚血瘀证组差异表达miRNAs火山图

图2 气滞血瘀证组和气虚血瘀证组差异表达miRNAs聚类图

2.3 差异性表达miRNAs的靶基因预测 通过miRDB和miRWalk两个数据库来共同对差异表达miRNAs进行靶基因预测，共筛选出175个miRNAs-mRNA关系对，详见图3。靶基因预测结果见表2。

图3 差异miRNAs靶基因预测数据库Venn图

表2 差异性表达的miRNAs及预测的靶基因结果

2.4 靶基因GO富集分析 本研究对差异表达靶基因分别进行生物学过程、分子功能和细胞组分的GO富集分析。结果表明，气滞血瘀证组和气虚血瘀证组差异有统计学意义的miRNAs预测靶基因主要参与生物过程调控、代谢调控、多细胞器官的发育、信号转导调控等过程。详见图4。

图4 差异miRNAs靶基因GO富集分析

2.5 靶基因KEGG富集分析 KEGG富集分析结果显示，这些差异靶基因在磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路、Wnt信号通路、Apelin信号通路富集，尤其在PI3K/Akt信号通路最显著，详见图5。结果提示冠心病气血失和证候形成的病理生理机制与这些通路密切相关，与气滞血瘀证相比，PI3K/Akt信号通路、Wnt信号通路、Apelin信号通路在气虚血瘀证中表现为显著下调。

图5 差异miRNAs靶基因KEGG富集分析

3 讨 论

中医理论体系中气和血为机体重要的物质和能量基础，中医所言“气为血之帅，血为气之母”，气血调和为生命之本，气血失常为百病之机。既往文献显示，气滞血瘀证和气虚血瘀证作为气血失和重要的两种表现类型，均为冠心病的核心病机[10]。目前临床气血辨证方法多数以经验为主，对气滞血瘀证和气虚血瘀证的微观物质基础未获得统一认识。随着生物信息学技术的发展，越来越多研究运用现代生物学技术探讨中医证候的生物学本质和病理生理机制，有利于中医证候理论的深化和推广。

miRNAs是一类长20～24 nt的内源性非编码核糖核酸分子，主要通过识别靶基因3′非翻译区的靶位点介导mRNA降解或翻译抑制发挥作用。这类miRNAs在进化上具有高度的保守性，表达具有时间和组织特异性，是调节其他功能基因表达的重要调节分子，在生物体的各种生命过程中发挥着重要作用[11-12]。中医领域里，通过探索相关靶标miRNAs分子，寻找宏观证候与微观物质基础的特定联系。有研究显示，miRNAs在血瘀证等中医证候的发生发展中发挥着关键的介导作用，其表达变化不仅可协助诊断，还可预测与疾病相关的分子信号机制[13-15]。本研究通过选择miRNAs芯片，利用其快速、平行、高通量的检测特点，以气滞血瘀证和气虚血瘀证急性冠脉综合征病人为研究对象，通过现代高通量测序技术和生物信息学方法分析气滞血瘀证和气虚血瘀证不同的微观生物基础及潜在的病理生理机制。结果发现两组血清存在13个差异性表达的miRNAs，包括11个表达上调的miRNAs和2个表达下调的miRNAs。广泛参与信号传导过程、生物过程调控等病理过程，进一步对差异靶基因行功能富集分析，结果显示这些差异靶基因在PI3K/Akt信号通路、Wnt信号通路、Apelin信号通路差异有统计学意义，尤其在PI3K/Akt信号通路富集最为明显。

既往研究已证实，PI3K/Akt/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路与冠心病的病理生理过程密切相关，PI3K激活导致Akt的磷酸化，被激活的PI3K/Akt通过调节Ser1177上的eNOS磷酸化，并与内皮细胞表面受体结合激活eNOS，之后催化L-精氨酸脱氨基产生一氧化氮(nitric oxide，NO)，调节内皮细胞增殖、分化、凋亡和迁移，参与血管收缩、血管平滑肌细胞增生、血管重塑和机能障碍等病理过程，进而促进动脉粥样硬化的形成[16-17]。本研究结果显示，与气滞血瘀证病人相比，气虚血瘀证病人可能通过下调PI3K/Akt信号通路，引起血管内皮功能障碍、血管痉挛、异常收缩、血栓形成及血管增生等病理生理过程的形成。与既往研究证实气虚血瘀证冠心病存在血管内皮功能异常，并贯穿发生发展过程的始终观点一致，且主要表现为NO和内皮素-1分泌失衡，血清NO/内皮素降低在气虚血瘀证病人尤为明显[18-19]。动物实验发现，对冠心病气虚血瘀证小鼠采用雪莲通脉丸等补气活血的中药治疗，通过升高血清NO水平、降低内皮素-1水平可改善血管内皮细胞功能失调和心肌缺血[20]。既往研究未完全阐明气虚血瘀证的基因作用通路，本研究结果推测上调PI3K/Akt通路以升高血清NO/内皮素含量可能是补气活血方改善气虚血瘀证小鼠内皮功能障碍的内在机制，仍需进一步对筛选出的差异miRNAs进行逆转录-聚合酶链式反应和多中心、大样本的临床研究验证。

综上所述，本研究利用高通量测序技术和生物信息学方法共筛选出气虚血瘀证和气滞血瘀证冠心病病人13个差异表达miRNAs可能参与气血失和证冠心病的发生和发展，进一步功能分析发现PI3K/Akt等信号通路下调可能参与气虚血瘀证冠心病病理生理机制的形成。该结果对进一步寻求中医证候生物学本质及标志物提供了一定的基础理论依据。