赵立群，邱艳红，张晓飞，刘慧，杨静静，张建，张海军，徐秀兰，温常龙

TaqMan探针法实时荧光定量PCR检测西瓜潜隐病毒

赵立群1，邱艳红2,3*，张晓飞2，刘慧2，杨静静2，张建2,3，张海军2,3，徐秀兰2,3，温常龙2,3*

1北京市农业技术推广站，北京 100029；2北京市农林科学院蔬菜研究中心/国家蔬菜工程技术研究中心，北京 100097；3农业农村部蔬菜种子质量监督检验测试中心，北京 100097

【目的】西瓜潜隐病毒（cryptic virus，CiLCV）是近年来新发生的一种重要种传病害，研究旨在建立基于TaqMan探针法的实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR with TaqMan probes，TaqMan-qPCR）检测技术，为开展种子、种苗带毒鉴定和病害防控提供技术支撑。【方法】通过基于小RNA高通量测序技术在北京西瓜产地发现了CiLCV，并克隆CiLCV的dsRNA1和dsRNA2全长序列，设计特异性引物建立RT-PCR和TaqMan-qPCR检测方法。以黄瓜绿斑驳花叶病毒（cucumber green mottled mosaic virus）、黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus）、甜瓜内源病毒（endornavirus）、瓜类褪绿病毒（cucurbit chlorotic yellows virus）、南瓜花叶病毒（squash mosaic virus）、番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus）、西瓜花叶病毒（watermelon mosaic virus）、小西葫芦黄花叶病毒（zucchini yellow mosaic virus）8种常见病毒为对照进行检测方法特异性分析；利用建立的实时荧光定量标准曲线对方法灵敏度进行评价；进一步利用TaqMan-qPCR和RT-PCR技术监测我国葫芦科作物主产区的西瓜、黄瓜、甜瓜和南瓜（砧木）种苗带毒情况。【结果】通过分析获得的高质量小RNA数据，发现17条组装的contig与CiLCV基因组有较好同源性。进一步克隆获得CiLCV的dsRNA1和dsRNA2序列全长（分别为1 603和1 466 nt），发现其与河南省鉴定出的CiLCV同源性高达99.4%和99.8%（GenBank number KY081285、KY081284）。建立的RT-PCR检测技术对CiLCV有单一扩增条带；建立的TaqMan-qPCR检测技术具有较好特异性和灵敏度，且能够检测到最低拷贝数为2×103的病毒，灵敏度是RT-PCR的100倍。同时，发现有1份来自北京的西瓜种苗检出了CiLCV，而其余地区的西瓜、黄瓜、甜瓜和南瓜（砧木）种苗均未检出该病毒，表明我国葫芦科作物主产区种苗带毒情况总体不高。……