刘明月，胡 阳，毛敏杰，康钰晨，李虎丹，李春林，常巧呈*

(1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319；2.浙江农林大学动物科技学院)

巴贝斯虫是属于顶复门(Apicomplexa)、孢子虫纲(Sporozoaside)、梨形虫目(Piroplasmorida)、巴贝斯虫科(Babesiidae)、巴贝斯虫属(Babesia.spp)的一类单细胞寄生虫。最初，巴贝斯虫的鉴定主要是通过红细胞内虫体形态来进行鉴别，随着聚合酶链式反应(PCR)等分子技术的出现，许多新的虫种和基因型相继被发现[1]。犬巴贝斯虫病是一种严重危害犬健康的重要蜱传性血液原虫病，引起该病的病原体有犬巴贝斯虫(Babesiacanis)、吉氏巴贝斯虫和韦氏巴贝斯虫(BabesiaWebster)三种，在我国主要为前两种[2]。其病原常寄生于犬的红细胞内，虫体常为圆形、卵圆形和梨籽型，有时在红细胞内可发现2个以上虫体[3-4]。可引起发热、贫血、黄疸等非特异性临床症状，严重感染甚至会导致死亡。犬巴贝斯虫病主要通过蜱传播，呈现出一定地方性和季节流行性，尤其在有蜱滋生的地区，春、夏、秋、冬季均可发病[5-6]。随着城市养犬数量增多，本病的发病率也越来越高，危害十分严重。

目前，用于该病诊断的免疫方法主要有补体结合反应、间接免疫荧光试验、间接血凝试验、被动血凝抑制试验、毛细管凝集试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫试验和标记抗补体荧光抗体试验等[7]。其中间接免疫荧光试验和补体结合反应较为敏感，但在临床应用中发现有时会出现使用不同的免疫学方法检测结果差异较大的情况，并且不能鉴定和区别虫种。直接法是通过染色镜检的方式直接在动物血液中观察到虫体，该方法对染虫率较高的急性感染病例检出率较高，而对隐性带虫感染病例检出率较低，而PCR技术是对该病诊断、鉴定、区别虫种较为敏感的技术。因此，本试验在临床检查，生理生化检查及血涂片镜检时发现红细胞中可见梨籽形状虫体，初步怀疑是巴贝斯虫病的基础上，使用梨形虫18S rDNA序列的PCR通用引物进行扩增，并对产物测序鉴定，与相关巴贝斯虫序列比对分析并构建进化树，对虫种进行鉴定分析，探讨虫体间的遗传进化关系，从分子水平上对病原进行鉴定和分类。

1 材料与方法

1.1基本情况 北京市某宠物医院于2020年6月1日接诊一例疑似吉氏巴贝斯虫感染病犬，病犬为比熊公犬，2岁4个月，体重6.2 kg。

1.2血常规检查 采取病犬前肢外侧隐静脉血少量，利用血液分析仪对病犬白细胞、红细胞和血小板计数，以及血红蛋白水平等系列参数进行分析。

1.3生化检查 采取病犬前肢外侧隐静脉血少量，放于离心管内，置高速离心机离心，血清备测。使用全自动生化分析仪对病犬血清进行各项常规生化指标的检验。

1.4血涂片检查 采集动物耳缘静脉或前肢静脉的血液，滴一滴于干净的载玻片上，用洁净盖玻片口呈30°- 40°角，快速且用力地推开血滴，使其成薄血膜，待其自然干燥后滴适量甲醇完全覆盖血膜涂片，使其固定，待甲醇自然挥发晾干后用DIFF QUIK A染液染色10 min，用流动的蒸馏水轻柔地冲洗玻片，注意不要直接冲洗血膜，晾干后在油镜下观察。

1.5分子生物学检查

1.5.1DNA提取 采取动物新鲜血液，按照TIANamp说明书提取DNA，置-20 ℃冰箱中保存，备用。

1.5.2PCR扩增 按照常规PCR扩增方法扩增18S rDNA部分序列。应用引物PIRO OF(5′-GCC AGT CAT ATG CTT GTG TTA-3′)，PIRO 6R(5′-CTC CTT CCT YTA AGT GAT AAG GTT CAC-3′)[8]，PCR扩增体系(总体积为25 μL)：上下游引物各0.5 μL；2×Taq Plus Master Mix Ⅱ 12.5 μL；模板1 μL；ddH2O 10.5 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min；55 ℃退火1 min；72 ℃延伸30 s；共35个循环；72 ℃延伸7 min。取PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5.3序列测定及进化分析 将PCR扩增产物送至库美生物科技有限公司测序，测序结果用DNASTAR 5.0软件分析，与GenBank上不同地区具有代表性的巴贝斯虫属的18S rDNA序列进行比较分析。用Clustal X 1.83软件和MEGA 6.0软件对本试验中及GenBank上相关犬巴贝斯虫18S rDNA序列比对分析，并用Maximum-Likelihood法共同构建系统发育进化树。

2 结果与分析

2.1临床及实验室检查 临床检查病犬精神沉郁，体弱消瘦，不愿活动，进食减少，可视黏膜苍白，牙龈苍白。血常规检查病犬白细胞和中性粒细胞绝对值数量增加，提示有细菌感染、过敏反应或者寄生虫感染。红细胞、血红蛋白数量降低，提示病犬处于贫血状态。血小板数量和红细胞压积偏低，推断与贫血有关(表1)。

表1 血常规检查异常指标

生化检查显示病犬总蛋白和球蛋白数量增加，总胆红素升高，表明机体有不同程度的溶血现象(表2)。

表2 生化检查异常指标

2.2血涂片检查 提取病犬血液，涂片并用DIFF QUIK A染色后，可以在油镜(1000×)下观察到红细胞内有染成蓝紫色的梨籽形虫体(图1)，确认犬巴贝斯虫感染，但具体虫种仍需其他方法进一步鉴定。

图1 患犬血涂片(箭头所指为虫体1000×)

2.3分子生物学检查

2.3.1PCR扩增结果 应用引物PIRO OF、PIRO 6R，利用PCR方法扩增，经琼脂糖凝胶电泳，扩增出大小约为1560 bp的DNA片段，得到了与阳性对照大小相似的条带(图 2)。

图2 病犬18 S rDNA PCR电泳结果图

2.3.2序列测定及进化分析 测序结果得到1条长度为1560 bp的核苷酸序列，将该序列提交GenBank(NCBI)其登录号为MW276038.1并与GenBank登录的相关巴贝斯虫序列进行对比分析，发现患病犬样本中获得的巴贝斯虫18S rDNA序列与Babesiagibsoni(MN928823.1)相似度为99.94%。以双芽巴贝斯虫(KM046917.1)为外群，与GenBank中不同国家和地区犬可感染的巴贝斯虫18S基因序列运用MEGA6.0软件采用ML法构建进化树，结果显示为犬可感染的巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫两个大的分支，该病犬基因序列与吉氏巴贝斯虫位于同一分支中，其中与来自中国西安株(MN928823.1)和日韩株(AB478330.1)亲缘关系较近[9](图3)。从分子水平上证实了本实验中扩增的虫体为吉氏巴贝斯虫。

图3 基于18 S rDNA序列构建的系统发育树

3 讨论

巴贝斯虫病主要通过蜱传播，在美国、澳大利亚、意大利、德国、韩国等国家均报道过人及动物感染的病例，我国近年关于犬巴贝斯虫感染的报道也在增加，在台湾、武汉、陕西、南京、北京、广东等地区均有感染病例的报道[10]。呈现出一定地方性和季节流行性尤其在有蜱滋生的地区，春、夏、秋、冬季均可发病。随着城市养犬数量增多，本病的发病率也越来越高，危害十分严重，要做好防蜱灭蜱工作。在流行区对于健康犬，可用贝尼尔进行预防注射，在易感染季节尽量不要带犬上山或到草坪处玩，若去蜱易存在的地方应事先给犬佩戴杀蜱项圈或涂福来恩等药物进行预防。此外，还要定期对健康犬进行药浴驱虫。现在国外一些地区已经广泛应用巴贝斯虫病弱毒疫苗或分泌性抗原疫苗进行预防接种[11-12]。

通过研究发现，病犬发病时通常表现为贫血、乏力、黄疸，红细胞、血红蛋白数量、血小板数量及红细胞压积降低，总蛋白和球蛋白数量增加，总胆红素升高。临床通常采用血涂片检查的方法，但该方法对染虫率较高的急性感染病例检出率较高，而对隐性带虫感染病例检出率较低，而PCR技术是对该病诊断、鉴定、区别虫种较为敏感的技术[7]。因此，本试验在临床检查，生理生化检查后，血涂片镜检时发现红细胞中可见梨籽形状虫体，初步怀疑是巴贝斯虫病的基础上，使用真核生物18S rDNA基因的PCR通用引物进行扩增，测序得到序列长度为1560 bp与GenBank登录的Babesiagibsoni(MN928823.1)同源性为99.94%。并以双芽巴贝斯虫(KM046917.1)为外群，用GenBank中不同国家和地区的巴贝斯虫18S rDNA序列构建进化树，通过比对发现其与中国西安株(MN928823.1)亲缘关系较近，与西班牙、美国株相对较远。本研究经临床检查、生理生化检查和血涂片检查确定该犬患有巴贝斯虫病，经分子生物学方法最终确定感染的巴贝斯虫病原为吉氏巴贝斯虫(B.gibsoni)。