基于适配体与聚多巴胺纳米粒的荧光内滤效应研究*

2021-10-25张梦丽兰慧宁王雪阳高一乔孙祥德

广州化工 2021年19期

张梦丽，兰慧宁，王雪阳，高一乔，孙祥德，李娜

(新乡医学院药学院，河南新乡 453003)

多巴胺(dopamine, DA)是脑内的一种儿茶酚胺类神经递质，具有与海洋贻贝分泌的粘附性蛋白成分类似的结构[1-2]。聚多巴胺纳米颗粒是一种近年来被广泛研究的新型纳米材料，其合成过程简单、成本低，具有良好的水溶性和生物相容性[3-4]。适配体[5]是一类通过体外分子进化技术从随机DNA库中筛选出的具有高效催化活性和特异性识别功能的DNA片段，它具有结合力强、选择性好、靶标范围广、生物相容性好、易合成和易功能化修饰等优点，为构建各种分子或者离子的荧光探针提供了分子识别的工具。适配体与纳米材料的结合既保留了适配体的催化特性和识别能力又引入了纳米材料的信号转导功能，实现了识别与信号转导功能的一体化，大大促进了生物传感器的快速发展[5]。基于此，本研究以聚多巴胺纳米材料做载体，研究其与具有特异性识别铅离子能力的适配体之间的内滤效应，为后期构建聚多巴胺-脱氧核酶[7-9]生物传感器来检测铅离子奠定基础，对环境监控和人类健康具有非常重要的意义。

1 实验

1.1 仪器与试剂

RF-5310PC荧光分光光度计，岛津企业管理(中国)有限公司；TG16-WS高速台式离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；ZNCL-B智能数显磁力加热板，河南爱博特科技发展有限公司；Malvern Zetasizer Nano ZS900纳米粒径电位分析仪，英国马尔文仪器有限公司；KQ2200B超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；NicoletiS50傅里叶变换红外光谱仪，美国赛默飞。

盐酸多巴胺，萨恩化学技术(上海)有限公司；氨水，烟台市双双化工有限公司；无水乙醇、异丙醇，天津市德恩化学试剂有限公司；实验中所用的寡核苷酸序列GR-5 DNAzyme均由宝生物工程有限公司(大连，中国)合成并且通过高效液相色谱法(HPLC)纯化；实验过程所用水均为去离子水。除非特别指明，其它的化学试剂均为分析纯，不需要进一步的纯化和处理，可以直接使用。

本实验所用的荧光仪，激发狭缝宽为8 nm，发射光的狭缝宽为8 nm，所用的激发波长为480 nm，发射波长为525 nm。

1.2 聚多巴胺纳米粒的制备与表征

1.2.1 聚多巴胺纳米粒子(PDANPs)的制备

取22.5 mL超纯水置于100 mL的圆底烧瓶中，置于磁力搅拌器上，水浴升温至30 ℃，依次加入10 mL无水乙醇、0.75 mL氨水，继续搅拌30 min。准确称取0.125 g盐酸多巴胺溶于2.5 mL去离子水中，完全溶解后迅速加入到上述混合液中，搅拌反应24 h。反应结束后，将悬浮液离心，用去离子水洗涤沉淀三次。最后，干燥沉淀以备后续实验。

1.2.2 聚多巴胺纳米颗粒的红外表征

采用傅里叶变换红外光谱仪扫描该聚合物的红外光谱。根据图谱中各峰的位置，分析并确定纳米粒的合成情况。

1.2.3 粒径与Zeta电位表征

采用动态光散射法测定聚合物胶束的粒径及粒径分布，用马尔文激光散射粒度仪测定其粒径分布以及Zeta电位。实验方法：吸取适量样品，在石英比色皿中测定两者的粒径分布，在Zeta电位检测池中测其Zeta电位。

1.2.4 形貌表征

使用透射电子显微镜观察聚多巴胺复合纳米颗粒的形貌特征。实验方法：先将颗粒分散在水溶液中得到其分散液，然后用去离子水进行适当的稀释，滴于铜网上，铜网暴露于室温环境下，待溶剂全部挥发时在透射电子显微镜上进行观测。

1.2.5 稳定性实验

制备PDANPs，透析48 h后，取透析液在室温下放置，每隔2 h取样，测其24 h的粒径，考察其粒径变化，重复三次，取粒径平均值作图。

1.3 荧光测定

将对铅离子特异性识别的脱氧核酶GR-5 DNAzyme和不同浓度PDANPs混合，测定其荧光信号的强度。实验方法：固定酶链和底物链的浓度30 nM，杂交反应10 min后，加入一系列不同浓度的PDANPs，反应10 min，测定荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 FTIR结果

图1 多巴胺(a)和聚多巴胺(b)的红外光谱图Fig.1 Infrared spectra of dopamine (a) and polydopamine (b)

由红外光谱图可以看出，多巴胺单体中，3340 cm-1和3210 cm-1处为-NH2的伸缩振动峰，3146 cm-1，3088 cm-1，3070 cm-1，2950 cm-1处为苯环上O-H的不对称伸缩振动峰，2638 cm-1，2530 cm-1，2400 cm-1处为N-H伸缩振动峰，1611 cm-1处为C=C伸缩振动峰。在聚多巴胺中，在3500～3000 cm-1处的宽峰，是氨基与羟基缔合后产生的吸收峰，3340 cm-1处的峰由于伯氨基转变为叔、仲氨基而消失，1644 cm-1,1504 cm-1处是多巴胺聚合后产生的吲哚结构的特征吸收峰。

2.2 粒径与Zeta电位

2.2.1 粒径结果

粒径是影响纳米粒的物理化学特性的重要参数之一。如图2所示,聚多巴胺纳米粒的粒径平均在270 nm，PDI平均0.1左右，粒径分布范围较窄。

图2 聚多巴胺纳米粒的粒径分布图Fig.2 Particle size distribution of polydopamine nanoparticles

2.2.2 Zeta电位结果

Zeta电位是指剪切面的电位，Zeta电位绝对值越高，越不易聚集，反之纳米粒间相互斥力减小，稳定性降低。图3中聚多巴胺纳米粒的Zeta电位为28.0，纳米粒具有一定程度的稳定性。

图3 聚多巴胺电位图Fig.3 Potential diagram of Polydopamine

2.3 透射电镜结果

由图4电镜图中可以看出，纳米颗粒为均匀的球状颗粒，尺寸均匀，颗粒之间无明显粘连，无破损现象。

图4 聚多巴胺纳米粒的透射电镜图Fig.4 TEM of polydopamine nanoparticles

2.4 稳定性结果

如图5所示，制备的聚多巴胺纳米颗粒分散性良好，不易发生聚集，在水溶液中能够保持一定程度的稳定性。

图5 聚多巴胺纳米粒在水中的粒径变化Fig.5 Particle size changes of polydopamine nanoparticles in water

2. 5 脱氧核酶与和聚多巴胺纳米粒的之间的反应机理

采用荧光光谱法和紫外可见吸收光谱法，考察脱氧核酶的激发光谱和聚多巴胺纳米粒的紫外-可见吸收光谱。如图6所示可以看出，在400～700 nm内，脱氧核酶的荧光发射光谱最大发射峰位于525 nm，而聚多巴胺纳米粒在200 nm到600 nm区间有较宽的吸收峰，且与聚多巴胺纳米粒发射光谱有较好地重叠，因此二者可能会产生荧光内滤效应。

图6 适配体的荧光发射光谱(a)和聚多巴胺纳米粒的紫外-可见吸收光谱(b)Fig.6 Fluorescence emission spectra of aptamers (a) and UV-visible absorption spectra of polydopamine nanoparticles (b)

图7 内滤效应示意图Fig.7 Diagram of internal filtering effect

2.6 聚多巴胺荧光猝灭能力的考察

随着聚多巴胺纳米粒浓度的逐渐增大，脱氧核酶上荧光团的荧光被逐渐猝灭，并且当聚多巴胺纳米粒的浓度达到0.8 mg/mL时，它的荧光猝灭效率达到了96.7%，荧光信号几乎被猝灭至基线水平。这一结果表明所制备的聚多巴胺纳米粒能够将杂交后的酶链和底物链吸附在表面，并能使底物链上链接的羧基荧光素的荧光猝灭，且其荧光猝灭能力较强。

图8 不同浓度的PDANPs下脱氧核酶的荧光图Fig.8 Fluorescence spectra of deoxyribozyme under different concentrations of PDANPs

2.7 猝灭机制的确定

荧光猝灭有两种不同的机制，分别为静态猝灭和动态猝灭。静态猝灭即荧光物质分子和猝灭剂形成一种静态配合物，随着温度升高，该配合物稳定性下降，使得静态猝灭常数减小；动态猝灭是荧光物质分子和猝灭剂之间发生碰撞作用，随着温度升高，动态猝灭扩散速率增大，使得动态猝灭常数增大。

根据 Stern-Volmer方程计算：

F0/F=1+kqτ0C=1+KSVC

①

其中: F0-适配体的荧光强度; F-加入聚多巴胺纳米粒后适配体的荧光强度; kq-猝灭速率常数，KSV-猝灭常数，C-猝灭剂浓度，τ0-没有聚多巴胺纳米粒存在时适配体荧光分子的平均寿命，约为10-8s。

根据式①，以F0/F 为纵坐标，C为横坐标作图可得聚多巴胺纳米粒子和适配体体系的Stern-Volmer曲线，如图9所示

由图9可得:曲线方程及相关系数为y=10.606x+0.4887, R2=0.9938，由上述信息计算可得：Ksv=10.606 L·mol-1，Kq=1.0606×109L·mol-1s-1，很显然Kq小于淬灭剂对荧光物质最大扩散控制的碰撞淬灭常数 2.0×1010L·mol-1s-1，由此可以得出结论：聚多巴胺纳米粒对适配体的荧光淬灭过程是动态的。