黄奕森，苏子剑，张剑华，潘剑辉，刘小瑜 (.福建医科大学附属泉州第一医院消化内科，福建 泉州 36000；.福建医科大学附属泉州第一医院肝胆外科，福建 泉州 36000)

神经降压素(NTS)是一个含有13个氨基酸的神经肽[1]， NTS广泛表达在人类和动物的大脑和胃肠道中。已有研究表明，NTS可以为多种类型上皮细胞来源的恶性肿瘤提供一种生长信号促进肿瘤的增殖，包括结肠癌乳腺癌[2-3]、肺癌[4]、胰腺癌[5]、前列腺癌[6]。NTS的作用由三种类型的NTS受体介导 (NTSRs)，包括高亲和力受体NTSR1和NTSR2，低亲和力受体NTSR3[7]。NTS高亲和力受体 NTSR1参与介导了NTS 的生理及病理作用。研究发现 NTS /NTSR1信号的异常与人类多种恶性肿瘤(如结肠癌[8]、前列腺癌[9]、恶性B淋巴细胞瘤[10]等)的发生发展关系密切。本次研究经过本院医学伦理委员会同意，旨在通过体内外实验确定NTSR1在胆管癌增殖浸润转移中的作用，初步探明NTS/NTSR1在胆管癌的增殖转移中的作用机制。现报告如下。

1 材料和方法

1.1主要实验材料及试剂:细胞增殖检测试剂MTS购自promega(G3581),Anti-Neurotensin Receptor 1/NTSR1 antibody (ab117592) ，Anti-ERK1 + ERK2 (phospho T202 + Y204) antibody [SP327] (ab223500)、Anti-p38 (phospho T180 + Y182) antibody (ab4822)、Recombinant Anti-JNK1 + JNK2 + JNK3 (phospho T183+T183+T221) antibody [EPR5693] (ab124956)及Anti-PKC alpha (phospho S657 + Y658) antibody (ab23513)和Anti-GAPDH antibody [mAbcam 9484]均购自ABCAM。试验用培养基及血清均购自Gibco公司,实验中耗材均购自GreinerBioOne。

1.2NTSR1特异性拮抗剂SR48692对人胆管细胞癌细胞HUCCT1-1增殖迁移影响:用MTS方法检测加入不同浓度5 μmol/L和10 μmol/L特异性拮抗剂SR48692后24 hr，48 hr，72 hr细胞增殖能力。通过transwell小室实验检测加入不同浓度5 μmol/L和10 μmol/L特异性拮抗剂SR48692后细胞迁移能力变化。

1.3筛选胆管癌细胞并进行改造：培养并收取相同数量的RBE、HUCCT1、HCCC 9810、 CCLP-1四株胆管癌细胞，用RIPA的方法提取蛋白质，用WESTERN BLOT的方法检测RBE、HUCCT1、HCCC 9810、 CCLP-1四株胆管癌细胞中NTSR1的表达差异，根据结果选出较高表达量的细胞株HUCCT1进行改造。 用慢病毒转染构建过表达NTSR1的细胞株HUCCT1-NTSR1和敲减NTSR1的细胞株HUCCT1-siNTSR1，WESTERN BLOT方法检测改造后细胞NTSR1的表达差异，体外通过MTS的方法检测改造后细胞株的增殖能力，用transwell小室实验检测迁移能力。在体内通过成瘤实验检测细胞的增殖能力。

1.4NTSR1分子与MAPK通路中的关键靶标分子相关性检测:用蛋白免疫印迹技术检测改造前后胆管癌细胞HUCCT1中NTSR1和MAPK通路三个关键活性分子ERK1/2、P38MAPK、JNK及显著差异表达基因PKC的蛋白磷酸化水平。进一步试验检测在过表达NTSR1胆管癌细胞细胞系中应用P38MAPK特异性抑制SB203580、ERK1/2特异性抑制剂U0126和JNK特异性抑制剂SP600125通道抑制剂后细胞增殖/侵袭/凋亡能力的变化。

2 结果

2.1NTSR1特异性拮抗剂SR48692对四株人胆管细胞癌细胞增殖迁移检测结果:通过MTS检测细胞增殖率， 检测结果如图1A所示：未给药组细胞增殖最快，以HUCCT1细胞为例，到第3天时细胞吸光值为0.83，是第一天吸光值0.156的5.32倍；给药浓度10 μmol/L细胞增殖最慢，到第3天时细胞吸光值为0.408，是第一天吸光值0.149的2.74倍；给药浓度5 μmol/L细胞增殖居中，到第3天时细胞吸光值为0.589，是第一天吸光值0.149的3.95倍。细胞迁移及浸润能力利用加martrigel和不加martrigel的transwell小室实验进行检测，统计细胞数量。结果如图1B和1C所示：未给药组细胞迁移和浸润能力高于给药组细胞，说明NTSR1特异性拮抗剂SR48692抑制了胆管细胞癌细胞的迁移及浸润。见图1。

图1 NTSR1抑制剂对胆管癌细胞系细胞生物学行为的影响

2.2NTSR1稳转细胞株建立:将培养的RBE、HUCCT1、HCCC 9810、 CCLP-1四株胆管癌细胞提取蛋白质，用WESTERN BLOT的方法检测RBE、HUCCT1、HCCC 9810、 CCLP-1四株胆管癌细胞中的NTSR1，结果如图2A所示：HUCCT1细胞表达量较高，选取该细胞进行改造。通过慢病毒转染HUCCT1细胞，构建过表达NTSR1的细胞株HUCCT1-NTSR1和敲减NTSR1的细胞株HUCCT1-siNTSR1，用WESTERN BLOT的方法检测改造后细胞NTSR1的表达差异。结果如下图2B所示，NTSR1在敲减后细胞株HUCCT1-siNTSR1，过表达细胞株HUCCT1-NTSR1与正常的HUCCT1表达差异明显，细胞株构建成功。

2.3改造后细胞株增殖迁移浸润检测:对改造成功的细胞HUCCT1-NTSR1，HUCCT1-siNTSR1进行增殖迁移和浸润的检测。结果如图3。MTS检测改造前后细胞增殖能力的改变，如图3A:过表达细胞株HUCCT1-NTSR1增殖最快，在第3天时细胞吸光值为1.123，是第1天吸光值0.151的7.44倍，敲减的HUCCT1-siNTSR1细胞增殖最慢，到第3天时细胞吸光值为0.523，是第一天吸光值0.146的3.58倍；正常的HUCCT1细胞增殖居中，到第3天时细胞吸光值为0.818，是第一

图2A：不同细胞NTSR1表达量检测;图2B：改造前后HUCCT1细胞株NTSR1检测图2 不同胆管细胞癌细胞及改建后HUCCT1细胞株NTSR1表达检测

天吸光值0.147的5.56倍。细胞迁移及浸润能力利用加martrigel和不加martrigel的transwell小室实验进行检测。结果如图3B和图3C所示：敲减组细胞迁移和浸润能力低于正常细胞，过表达细胞组迁移和浸润能力高于正常细胞，说明NTSR1表达量差异影响了胆管细胞癌细胞的迁移及浸润，表达越高，迁移浸润能力越强，反之则越弱。体内成瘤试验结果显示：HUCCT1-NTSR1细胞皮下接种的10只裸鼠在第3周时有9只成瘤，HUCCT1-siNTSR1细胞接种的10只裸鼠中在第5周有4只成瘤，其他6只未能成瘤。HUCCT1细胞接种的10只裸鼠在第4周有7只成瘤，另有一只在第5周成瘤，另外2只未能成瘤。结果显示HUCCT1-NTSR1细胞成瘤最快，成瘤数量最多。

图3A：MTS检测改造后胆管癌细胞增殖率;图3B：使用transwell进行迁移测定;图3C：使用涂有Matrigel的Boyden室进行浸润测定图3 改造后胆管癌细胞系细胞增殖迁移浸润能力检测

2.4改造后细胞株增殖迁移浸润检测:用蛋白免疫印迹技术检测胆管细胞癌细胞HUCCT1以及敲减NTSR1的细胞株HUCCT1-siNTSR1中MAPK通路三个关键活性分子ERK1/2、P38MAPK、JNK及显著差异表达基因PKC的蛋白磷酸化水平变化，结果如图4A所示，敲减 NTSR1后ERK1/2磷酸化水平明显下降，预示NTSR1可能与MAPK通路的ERK1/2磷酸化水平相关。

进一步试验在过表达NTSR1的胆管细胞癌细胞细胞系中应用P38MAPK特异性抑制SB203580、ERK1/2特异性抑制剂U0126和JNK特异性抑制剂SP600125处理细胞，检测在抑制剂作用下细胞增殖，侵袭以及凋亡的变化。结果如图4B、图4C、图4D所示：加入P38MAPK特异性抑制SB203580和JNK特异性抑制剂SP600125通道抑制剂，增殖，侵袭和凋亡的变化差异不显著。而加入ERK1/2特异性抑制剂U0126，细胞增殖能力和侵袭显著下降，凋亡比例上升。证实NTS/NTSR1轴与MAPK信号通路ERK1/2有关。

图4A：敲减NTSR1前后ERK1/2、P38MAPK、JNK及PKC磷酸化水平检测;图4B： 加入抑制剂后细胞增殖能力检测;图4C：加入抑制剂后细胞侵袭能力检测;图4D：加入抑制剂后细胞凋亡检测图4 NTS/NTSR1轴作用与MAPK通路的ERK1/2相关

3 讨论

胆管癌(CCA)是一种罕见的腺癌，起源于胆管上皮细胞，位于肝内外胆管的任何部位，不包括壶腹和胆囊。它是世界范围内最致命的原发性肝脏恶性肿瘤之一，也是最常见的胆道恶性肿瘤[10-11]。CCA患者的转移和术后复发率很高，因此CCA患者的预后仍然很差[12]。在之前的研究中首次阐明神经降压素NTS过度表达与CCA患者预后不良密切相关的研究，提示NTS可能是CCA患者预后良好的生物标志物[13]。NTS的各项生理功能主要通过与其结合的神经降压素受体(neurotensin receptors，NTSRs)介导，目前已知的受体有3种，分别是NTSR1，NTSR2和NTSR3。其中NTSR1和NTSR2为NTS特异性受体，都属于G蛋白耦联受体家族(G-protein-coupled receptors，GPCRs)成员，且都具有7次跨膜区，但NTS与NTSR1高度亲和，而与NTSR2亲和力较低。

本文旨在研究NTSR1在胆管癌细胞的增殖，迁移，浸润中的作用，探明NTS/NTSR1在胆管癌的增殖转移中的分子机制。通过研究发现NTSR的特异性抑制剂SR48692能有效的抑制胆管癌细胞HUCCT1的增殖，迁移和浸润。改造HUCCT1细胞NTSR1的表达，检测发现敲减NTSR1的细胞HUCCT1-siNTSR1的增殖，迁移，浸润能力远低于过表达的细胞株HUCCT1-NTSR1，未改造的细胞HUCCT1的增殖，迁移和浸润能力居于二者之间。体内成瘤实验结果显示，HUCCT1-NTSR1成瘤率最高，HUCCT1居中，HUCCT1-siNTSR1成瘤率最低。研究结果显示，NTSR1特异性拮抗剂SR48692对人胆管细胞癌细胞增殖侵袭均有抑制作用,NTSR1在细胞内表达差异影响胆管癌细胞侵袭转移。用蛋白免疫印迹技术检测改造后胆管细胞癌细胞HUCCT1中MAPK通路三个关键活性分子ERK1/2、P38MAPK、JNK及显著差异表达基因PKC的蛋白磷酸化水平变化，结果显示敲减NTSR1后ERK1/2磷酸化水平明显下降，预示NTSR1可能与MAPK通路的ERK1/2磷酸化水平相关。进一步应用P38MAPK特异性抑制SB203580、ERK1/2特异性抑制剂U0126和JNK特异性抑制剂SP600125处理细胞，验证结果显示P38MAPK特异性抑制SB203580和JNK特异性抑制剂SP600125对细胞增殖，迁移和凋亡影响不显著，而ERK1/2特异性抑制剂U0126对细胞增殖、迁移和凋亡影响显著，证明NTS/NTSR1轴与MAPK信号通路ERK1/2有关。