蒋文青 ，张可 ，叶更新 ，孙亚妮 ，魏兰兰 ，刘博 ，李泽 ，易诚 *

（1.南岳山区生物资源保护与利用湖南省重点实验室，衡阳师范学院生命科学与环境学院，湖南 衡阳 421008；2.南阳市质量技术监督检验测试中心，河南 南阳 473000）

含氯消毒剂占据了消毒剂市场较大份额，而传统的氯制剂存在刺激大、不稳定、易残留等问题[1]。二氧化氯（ClO2）作为目前国际上公认的A1 级消毒剂，具有安全、广谱、高效、pH 值适用范围广等特点，其在低浓度（＜10 mg/L）下有杀菌、消毒作用[2-4]。二氧化氯通过抑制蛋白质的合成、引发氨基酸链断裂、改变细胞膜的通透性、破坏ATP 酶、脂质过氧化等机制[5-11]高效杀灭细菌、真菌及各种孢子、病毒、藻类等微生物[2，11-13]。二氧化氯可有效去除锰、氰化物、硫化物、苯酚和有机物[11-12]，具有不产生“三致”作用、无残留、安全和可持续消毒等优点，已成为氯系消毒剂的理想替代品[3，11]。目前已广泛应用于畜牧养殖、造纸制浆漂白、食品保鲜、饮用水处理、医疗消毒、农业种植土壤消毒[14]、公共环境空间消毒[13]等领域[2-3]。

菌氨清是一种二氧化氯缓释制剂，在水中能持续稳定释放二氧化氯。现通过设置不同的变量来评估菌氨清对大肠杆菌的杀灭效果和对鲫鱼的急性毒性，为其在水产养殖领域使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

菌氨清主要成分为二氧化氯，由某公司制备提供，50 g/袋（生产批号：20190307）；Top 10 大肠杆菌，由衡阳师范学院畜禽养殖生物工程技术研究所保存；胰蛋白胨和酵母提取物购自Oxoid Ltd 公司；琼脂粉购自Bio Froxx 公司；Na2HPO4等常规化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 菌氨清母液配制

将1 g 菌氨清溶于1 L 灭菌蒸馏水，有效成分质量浓度为100 mg/L，待黄色液体全部析出，混匀放置 10 min，即为母液，10 h 内用完。

1.3 菌氨清杀菌效果试验

1.3.1 大肠杆菌的活化与浓度确定 将200 μL 大肠杆菌接种到装有4 mL 液体培养基的试管中，37 ℃，160 r/min，培养 16～20 h。取 1 μL 活化后的菌液于EP 管中，按照倍比稀释法，用灭菌PBS 缓冲液将其稀释 103，106，109，1012倍，分别取 100 μL涂于LB 平板，37 ℃培养16 h，菌落计数，计算原菌液浓度。

1.3.2 菌氨清对大肠杆菌的杀灭效果 菌氨清试验组分 3 个剂量组：10 mg/L 组、1 mg/L 组、0.1 mg/L组，设立灭菌PBS 缓冲液作对照组。每组取1 mL 溶液于灭菌 EP 管中，加入 10 μL 菌液（6×105CFU/mL），混匀，分别于5 ℃和25 ℃（每个温度、每组设3 个重复）处理 1，10，20 min；12 000 r/min 离心 2 min 收集菌体，弃上清液，用100 μL 灭菌PBS 缓冲液混匀，涂于LB 平板，37 ℃培养16 h，菌落计数，计算杀菌效率。杀菌效率=（杀菌前大肠杆菌总数-杀菌后大肠杆菌总数）/杀菌前大肠杆菌总数×100%。

1.4 菌氨清对鲫鱼的急性毒性试验

1.4.1 试验鱼 试验鱼购自湖南省衡南县潭子山镇人工养殖场，选择规格相近的健康鲫鱼，体长7.9～9.2 cm，体质量 20～22.5 g，用经过充分曝气、水温为（13.0±1.5）℃的自来水暂养试验鱼一周，进行日常管理和投喂，每天换水。试验前两天不喂食，选择规格整齐、身体健康的鲫鱼随机分组进行试验。

1.4.2 试验条件 试验在64 cm×45 cm×38 cm 的水族箱中进行。试验用水为曝气3 d 除氯的自来水，水温为（13.0±1.5）℃，pH 值为 8.68，溶解氧含量保持在6.0 mg/L 以上。

1.4.3 试验方法 根据静水式生物测试方法[15]，试验期间每天更换药液，不喂食、不充氧，更换药液时，换充分曝气的水。试验期间测定水温、pH 值、溶解氧和细菌总数变化。

根据《水生生物毒性试验方法》[16]进行预试验，设置 5 个质量浓度：1，10，20，40 和 80 mg/L，并设置对照组。每组10 尾鱼，试验进行48 h，多次重复，找出绝对致死浓度（LC100）和最大耐受浓度（LC0）。再确定正式试验质量浓度分别为 1，2，4，6，8，10 和12 mg/L，并设置对照组。每组20 尾鱼，重复3 次。试验开始后前8 h 连续观察，记录试验鱼的行为和存活情况。若鱼鳃盖停止活动且5 min 内轻微刺激没有反应，则判定鱼死亡，捞出死鱼，记录死亡时间。记录 24，48，72 和 96 h 的存活情况，采用直线内插法（straight-line intepolation），横坐标为质量浓度对数，纵坐标为死亡率，计算半致死浓度（LC50）[16]；安全浓度=96 h LC50×0.1。测定放鱼前与放鱼24 h 后水体pH 值，放鱼24 h 各组分别取 100 μL 水样涂于LB 平板，37 ℃培养 16 h，菌落计数。

1.5 数据处理

利用SPSS 23.0 软件对试验数据进行统计分析，用平均数±标准差（Mean±SD）表示试验数据。将试验组与对照组的菌落数进行t 检验，以确定差异的极显著水平（P＜0.01）；用单因素方差分析法中最小极差法（LSD）比较组间差异，以确定差异显著水平（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 菌氨清对大肠杆菌的杀灭效果

经涂板、菌落计数可知，活化培养的大肠杆菌原液浓度为 6×109CFU/mL。温度为 5 和 25 ℃、质量浓度为1 和10 mg/L 的菌氨清分别处理1，10，20 min后发现，无大肠杆菌生长，杀菌效率为100%；对5 ℃、0.1 mg/L 组处理 1，10，20 min 后，杀菌效率依次为97.5%，98.7%，98.9%；对 25 ℃、0.1 mg/L 组处理 1，10，20 min 后，杀菌效率依次为99.2%，99.4%，99.6%。经统计差异显著性分析，菌氨清可极显著杀灭大肠杆菌（P＜0.01）。温度为 5 和 25 ℃、质量浓度为 0.1 mg/L 的实验组，处理时间对大肠杆菌杀灭效果影响极显著（P＜0.01）；0.1 mg/L 试验组经过不同处理时间后，温度对大肠杆菌杀灭效果影响极显著（P＜0.01）；温度为5 ℃的试验组经过不同处理时间后，菌氨清质量浓度对大肠杆菌杀灭效果影响极显著（P＜0.01）（表1）。

表1 菌氨清对大肠杆菌的杀灭效果①

2.2 菌氨清对鲫鱼的急性毒性试验

2.2.1 鲫鱼对菌氨清的中毒反应 高浓度组（＞4 mg/L）中毒症状主要表现为鱼体失去平衡、呼吸困难、鳃盖及口部不时张大等，鱼先上浮后沉底，体色变淡，3 h 后开始出现死亡，死亡鱼体向一侧弯曲。低浓度组（＜4 mg/L）中毒特征和高浓度组相同，出现症状时间较晚，长时间挣扎才会死亡。各浓度组死鱼的体表和鳃部黏液多。

2.2.2 菌氨清对鲫鱼的急性毒性作用 记录24，48，72 和 96 h 的死亡数（表 2）。

由表2 可见，高浓度组（＞4 mg/L）试验鱼24 h内死亡过半。如1 mg/L 组，24 h 鲫鱼的死亡率为0；2 mg/L 组，24 h 鲫鱼的死亡率为15%，增幅为15%。而当菌氨清浓度从 2 mg/L 增为4 mg/L 时，24 h 鲫鱼的死亡率为45%，增幅为30%，且死亡时间接近。最高浓度 12 mg/L 组，3 h 开始死鱼，6 h 死亡率达到100%，且死亡的时间集中。

2.2.3 半致死浓度和安全浓度 用直线内插法处理表2 数据，得出菌氨清对鲫鱼24，48，72 和96 h的LC50值并计算其安全浓度（表3）。

表2 菌氨清对鲫鱼的急性毒性试验结果

由表3 可见，菌氨清对鲫鱼的半致死浓度为1.39～4.10 mg/L，安全浓度为 0.139 mg/L。

表3 菌氨清对鲫鱼的急性毒性试验数据的线性回归分析

2.2.4 菌氨清在鲫鱼急性毒性试验中对pH 值和细菌总数的影响 放鱼前，质量浓度为 0，1，2，4，6，8，10 和 12 mg/L 的试验组水体 pH 值依次为 8.68，8.36，8.21，7.98，7.73，7.65，7.64，7.68；放鱼 24 h 后，质量浓度为 0，1，2，4，6，8，10 和 12 mg/L 的试验组水体 pH 值依次为 7.54，7.18，7.15，7.09，7.29，7.24，7.22，7.35（图 1）。

由图1 可见，试验所用自来水中未检出细菌，将试验鱼放入24 h 对照组与各浓度组的水中，细菌总数随着菌氨清浓度的升高而降低。

图1 菌氨清在鲫鱼急性毒性试验中对pH 值和细菌总数的影响

3 讨论

随着菌氨清质量浓度的增加，作用时间越长，杀菌效果越好。不同学者使用不同类型的含氯消毒剂对不同种类的细菌杀灭效果差异较大。张亚尼等[17]用300 mg/L 有效成分为次氯酸钠的两种消毒剂作用5 min，50 mg/L 有效成分为三氯异氰尿酸的消毒剂和150 mg/L 有效成分为二氯异氰尿酸钠的消毒剂作用10 min，对大肠杆菌杀灭率分别为100%，99.99%和 99.999%；王妍彦等[4]用0.05 mg/L 二氧化氯消毒液对大肠杆菌作用24 h，平均杀菌效率为 98.94%；Ofori 等[10]用 5.0 mg/L 的二氧化氯能杀灭水中的铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌；Ríos-Castillo 等[18]研究得出次氯酸钠与其他化合物如氢氧化钠等复配时才能有长期的抗菌效果。Orr 等[19]研究表明500 mg/L 的次氯酸钠对苹果表面的脂环酸芽孢杆菌杀灭率不高。本试验结果显示菌氨清对大肠杆菌的杀灭效果优于王妍彦等[4]的研究结果，且在较短时间，使用较少量便能有效杀灭大肠杆菌。

菌氨清对鲫鱼的半致死浓度为1.39～4.10 mg/L，安全浓度为0.139 mg/L。根据化学药物对鱼类毒性等级评价标准[20]，菌氨清对鲫鱼为有毒药物。不同学者使用相同类型的消毒剂对不同种类的鱼进行急性毒性试验时，得到的结果差异较大。二氧化氯对鳜鱼苗的半致死浓度为3.66～8.75 mg/L，安全浓度0.37 mg/L[15]，对黄颡鱼的半致死浓度为32.481～48.497 mg/L，安全浓度为 3.2481 mg/L[21]，对攀鲈幼鱼的半致死浓度为77.74～89.69 mg/L，安全浓度为24.691 mg/L[22]；本试验结果与丁淑荃等[15]试验结果相似，与其他学者的试验结果差别较大，可能与消毒剂剂型的不同、消毒剂中有效成分含量的不同和鱼的种类不同有关。1 mg/L 菌氨清对放养鱼的水体杀菌效果不佳，但其对大肠杆菌杀灭效果好，可能是因为鱼体携带的细菌数量过于庞大，低浓度的菌氨清无法将其全部杀死；10 mg/L 菌氨清对大肠杆菌和放养鱼的水体杀菌效果好，但其在杀灭细菌时易造成鲫鱼的死亡。因此，用菌氨清对鲫鱼消毒时，建议质量浓度不应超过0.139 mg/L，使用菌氨清后保持一定的休药期，避免其带来负面影响。