崔 凯，支亚男，王壮壮，公孙鑫，白峻峰

(西安国际医学中心医院胸腔外科，陕西 西安 710100)

非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)是呼吸系统常见肿瘤[1]。因高发病率和致死率，NSCLC在世界范围内成为研究热点[2-3]。肿瘤细胞的侵袭和转移能力对肿瘤在体内的远端转移具有非常重要的意义[4]。研究[5]显示NSCLC中肺癌细胞具有较强的远端转移和形成新病灶的能力，但是转移机制尚不清楚。微小RNA(miR)是近些年在肿瘤中研究发现的一类具有重要生物调节功能的小分子RNA，其对肿瘤异常增殖、侵袭和转移能力都具有直接或者间接的调控作用[6]。研究[7-8]发现，miR-30在多种恶性肿瘤(如胃癌、结肠癌、肝癌等)中发挥促癌作用，但是其在NSCLC中作用如何，是否同样发挥促癌作用，目前鲜有报道。因此，本研究观察miR-30对NSCLC侵袭和转移能力的影响，并分析其作用机制。

1 材料与方法

1.1 病理标本 收集本院收治的30例NSCLC患者的癌组织和癌旁组织，所有患者均经病理确诊，患者及其家属对本研究知情同意。

1.2 主要试剂 人肺癌细胞系A549细胞和正常肺支气管上皮细胞系HBE细胞购自中科院上海细胞库；DMEM(No.102432)、胎牛血清(No.542354)、胰酶(No.643421)和青链霉素混合液(No.175423)购自Gibco公司；Lipofectamine 2000转染试剂购自Invitrogen公司；Transwell小室购自Corning公司；白细胞介素-6(IL-6，No.1035332)、信号转导和转录活化因子3(STST3，No.7654543)、p-STAT3(No.2453245)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(No.7865453)购自Abcam公司；ECL化学发光试剂盒(No.2457)购自上海碧云天公司。

1.3 细胞培养及转染 将细胞随机分配到不同组，用小干扰RNA(siRNA)和相应的阴性对照(siNC)转染它们。每组包含3×105个细胞，用Lipofectamin 2000进行细胞转染。在转染前24 h将细胞接种在6孔板中，融合30%～40%。每次转染使用siRNA和siNC各20 nmol/L。

1.4 实时定量反转录PCR(qRT-PCR)检测RNA表达 将临床肺癌及癌旁组织样本匀浆后和细胞样本分别加入1 ml TRIzol裂解液提取总RNA，随后采用Takara公司5×Prime Script RT Master Mix反转录试剂盒获得总cDNA，基因相对表达量根据2-ΔΔCT法进行计算。qRT-PCR引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 CCK-8细胞增殖实验 取对数生长期A549细胞转染miR-30 mimic和miR-30 inhibitor，8 h后换完全DMEM培养基继续培养24 h。细胞密度1×104接种至96孔板，分别于接种后1～5 d每孔加入10 μl CCK-8溶液，37 ℃、5% CO2条件下继续孵育1～4 h。酶联免疫检测仪在450 nm处读取吸光值(OD)并绘制细胞生长曲线。

1.6 Transwell迁移与侵袭实验 细胞基质胶用预冷的无血清DMEM培养基以1∶9稀释，每孔加40 μl，37 ℃孵育5 h后水化基底膜。取对数生长期A549细胞转染miR-30 mimic和miR-30 inhibitor， 8 h后换完全DMEM培养基继续培养24 h。采用0.25%胰蛋白酶消化、中和，离心并重悬细胞于无血清DMEM培养基，每孔接种5×104个细胞于24孔培养板内的Transwell小室上室中，下室加入600 μl含10% 胎牛血清的完全DMEM培养基，37 ℃、5%CO2条件下于孵箱中培养，每种细胞设置3个复孔。待细胞迁移14 h和侵袭20 h后取出培养板并弃上清，PBS清洗后分别加入600 μl 4%多聚甲醛和0.1%结晶紫染液于室温下固定和染色15 min，PBS清洗后用棉签轻轻擦去Transwell小室上室中未迁移和侵袭细胞。倒置相差显微镜下随机选择5个视野观察被染成紫色的穿过膜的细胞，拍照记录细胞迁移和侵袭情况。

1.7 Western blot检测蛋白表达 取对数生长期A549细胞转染miR-30 mimic和miR-30 inhibitor， 8 h后换完全DMEM培养基继续培养24 h。采用0.25%胰蛋白酶消化、中和，离心并重悬细胞后加入100 μl PIPA裂解液和0.15 μl PMSF裂解液于室温下裂解细胞5 min，4 ℃离心15 min，吸取上清，进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳和转膜，一抗IL-6、STAT3和p-STAT3避光孵育，4 ℃冰箱过夜。次日孵育二抗，ECL发光仪检测。

2 结 果

2.1 miR-30在癌组织与癌旁组织、A549细胞与HBE细胞中的表达比较 见图1。miR-30在癌组织中表达显著高于癌旁组织，在A549细胞中表达显著高于HBE细胞(均P<0.05)。

注：图A中，与癌旁组织比较，*P<0.05，**P<0.01；图B中，与HBE细胞比较，**P<0.01

2.2 miR-30 mimic和miR-30 inhibitor转染后miR-30表达变化 见图2。qRT-PCR结果显示，A549细胞转染miR-30 mimic后miR-30表达上调4.142倍，miR-30 inhibitor转染后miR-30表达降低76%(均P<0.05)。

注：与Control组比较，**P<0.01

2.3 miR-30对A549细胞迁移能力的影响 见图3。

Transwell结果显示，miR-30 mimic转染后穿膜细胞数显著多于对照组，而miR-30 inhibitor转染后穿膜细胞数显著少于对照组(均P<0.05)。

2.4 miR-30对A549细胞侵袭能力的影响 见图4。Transwell结果显示，miR-30 mimic转染后细胞侵袭能力显著强于对照组，而miR-30 inhibitor转染后细胞侵袭能力显著弱于对照组(均P<0.05)。

2.5 miR-30对IL-6和STAT3 mRNA表达的影响 见图5。qRT-PCR检测结果显示，miR-30 mimic转染后A549细胞中IL-6和STAT3的mRNA表达显著增加，miR-30 inhibitor转染后IL-6和STAT3的mRNA表达随之降低(均P<0.05)。

注：与Control组比较，**P<0.01

注：与Control组比较，**P<0.01

2.6 miR-30对IL-6和STAT3蛋白表达的影响 见图6。Western blot结果表明，miR-30 mimic转染后A549细胞中IL-6和STAT3蛋白表达显著增加，而miR-30 inhibitor转染后IL-6和STAT3蛋白表达随之降低(均P<0.05)。

注：与Control组比较，**P<0.01

3 讨 论

肺癌是全球范围内导致死亡的主要癌症之一，多数肺癌患者即使经过手术及放化疗等联合治疗，术后总体5年生存率仍低于20%[9]。肺癌患者中NSCLC约占80%[10]。目前针对NSCLC的治疗虽然已经取得一定的进展，但是NSCLC具有较高的侵袭和远端转移能力，可在患者体内形成新的病灶，导致患者术后恢复较差且生存率低[11-13]。因此，探究NSCLC发生、发展的原因并进一步揭示其高侵袭和转移能力的分子机制具有重要临床意义。

miR-30是一种具有多种细胞功能的调节因子[14]。研究[15]发现miR-30参与了人体多种生物学过程。例如，miR-30促进恶性胶质瘤患者内源性神经干细胞(NSC)的大量增殖和迁移，且这种增殖和迁移在患者临床进程中随着肿瘤恶化程度达到高峰，随后是一段较长的分化、存活和整合期[16]。此外，miR-30过表达抑制导致NSC增殖率下降的机制及其伴随的代谢变化取得一定进展[17]。最近的研究[18]表明，miR-30异常表达能够介导缺血缺氧后胃癌和膀胱癌的发生与发展。同时，研究证实miR-30过表达通过介导肿瘤细胞的有氧糖酵解进而促进乳腺癌的恶性发展。

注：与Control组比较，**P<0.01

IL-6/STAT3信号通路被证实与多种肿瘤的异常激活密切相关，其与肿瘤微环境中的多种炎症因子相关，并且激活肿瘤微环境中炎症因子的表达，从而促进肿瘤的异常增殖和侵袭等恶性生物学行为。IL-6作为一种促炎因子，在多种肿瘤中呈异常高表达，现有研究证实其不仅可以促进炎性因子的表达，同时会导致肿瘤相关mRNA的异常表达，在结肠癌中IL-6促进miR-31的分泌从而激活结肠癌细胞的异常增殖。同时，IL-6可以激活STAT3的磷酸化，激活STAT3信号通路，从而抑制肿瘤细胞凋亡。STAT3激活不仅会使基因转录失调，促进细胞增殖、血管生成和肿瘤转移，而且还影响调控细胞凋亡的小分子RNA的表达变化[19]。但是目前在NSCLC中关于miR-30与IL-6/STAT3信号通路相互关系的研究较少。

本研究通过比较30例临床不同病理分期NSCLC患者的癌组织与癌旁组织、人肺癌细胞系A549细胞与正常肺支气管上皮细胞系HBE中miR-30的表达，分析miR-30对IL-6/STAT3信号通路活性的影响，揭示NSCLC发生与发展的新机制。结果表明，miR-30在NSCLC患者癌组织和A549细胞中的表达较癌旁组织和HBE细胞明显升高。miR-30 mimic转染后的A549细胞中IL-6/STAT3信号通路显著激活，同时明显增强细胞的侵袭和迁移能力，而miR-30 inhibitor转染后的A549细胞中IL-6、STAT3 mRNA及蛋白表达水平明显降低，同时细胞的侵袭和迁移能力明显受到抑制，表明miR-30的异常表达与NSCLC的发生与发展密切相关。

综上所述，miR-30能促进NSCLC侵袭和转移能力，其机制可能与激活IL-6/STAT3信号通路有关。因此，靶向miR-30有望成为临床抗NSCLC转移治疗的新路径，同时可考虑将血清miRN-30作为NSCLC患者早期诊断及预后指标。