吴皓宇，曹怿玮，汪玲果，常凤军，刁佳宇

(陕西省人民医院，陕西 西安 710068)

随着我国社会老龄化和城市化进程速度加快，人们生活水平提高后居民不健康生活方式的普及，心血管危险因素普遍暴露，冠心病的发病率和病死率具有逐年升高并呈现出年轻化的态势，已经进展为威胁人类健康的重要疾病。动脉粥样硬化斑块的形成是冠心病发病的重要病理基础，深入研究动脉粥样硬化斑块形成的机制，早期干预动脉粥样硬化斑块的发生及稳定性，建立有效防治动脉粥样硬化的策略变得极为迫切。

基质金属蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2，MMP-2)是基质金属蛋白酶家族中重要的一员，主要来源于内皮细胞、血管平滑肌细胞和成纤维细胞等，是一种酶活性锌离子依赖性肽链内切酶家族[1]。MMP-2具有多种生物学效应，生理状态下参与机体的正常发育，当机体受到不利刺激或在病理条件下时MMP-2表达增加和活性增强，其主要功能是降解细胞外基质，影响细胞与细胞和基质之间的信号传递，对细胞的生长分化、迁移、黏附、损伤及修复等方面产生影响，在促进动脉粥样硬化斑块形成、降低斑块稳定性和促进恶性肿瘤转移等方面起重要作用[2]。血管生成素-2(Angiopoietin，Ang-2)是血管生成素家族的一员，通过与血管内皮生长因子结合，促进新生血管生成。Ang-2本身能增加血管的通透性，增强单核细胞的生存能力，促进单核细胞迁移，同时增强肿瘤坏死因子-α诱导的单核细胞粘附等。因此Ang-2被认为是炎性因子，在动脉粥样硬化形成过程中发挥作用，在急性冠脉综合征患者中表达明显增加[3]。Ang-2还在许多恶性肿瘤组织中表达增加，参与肿瘤组织的转移，通过肿瘤病理组织分析发现，Ang-2可能通过整合素αvβ1促进MMP-2表达进而促进肿瘤转移[4]，但在动脉粥样硬化中缺乏相关研究。Ang-2和MMP-2在动脉粥样硬化斑块进展及稳定性中的相互作用和关系目前仅局限于临床观察，缺乏具体机制的探讨，尚无体外实验依据。本研究通过细胞实验探讨Ang-2与MMP-2的关系及可能的作用机制，为进一步探讨两者在动脉粥样硬化中的作用和关系提供实验支持。

1 材料和方法

1.1 实验材料 人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)购自武汉益普生物科技有限公司。Ang-2腺病毒和αvβ1 siRNA腺病毒购自赛业生物科技有限公司。抗Ang-2、αvβ1和MMP-2多克隆抗体购自Abcam公司。

1.2 HUVECs培养和分组 HUVECs接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，细胞贴壁生长，将培养基置于5%CO2、37 ℃培养箱中。细胞长至融合时用0.25%胰蛋白酶消化、传代。HUVECs形态为多角形，单层紧密排列。当细胞汇合度达到80%左右时，终止消化，用移液器头端吹打培养瓶底部，成为细胞悬液。将细胞接种于12孔培养板中(每孔200 μl，密度约为105/ml细胞)，将其分为四组：①对照组(NC):未干预的HUVECs；②空腺病毒转染组(Ad)：空腺病毒(50 pfu/ml)转染HUVECs；③Ang-2腺病毒转染组(Ad-Ang-2)：Ang-2腺病毒(50 pfu/ml)转染HUVECs；④αvβ1 siRNA+Ang-2腺病毒转染组(Ad-αvβ1 siRNA+Ang-2)：αvβ1 siRNA和Ang-2腺病毒(各50 pfu/ml)共同转染HUVECs。每组6个复孔，然后将培养板置于培养箱中72 h。

1.3 Western blot检测蛋白表达水平 将培养板从培养箱中取出，丢掉上清液，加入蛋白裂解液，移至1.5 ml离心管中，离心10 min，将上清液移至新的离心管中。于-80 ℃冰箱中保存备用。用Western blot法检测Ang-2、αvβ1和MMP-2蛋白表达水平，以化学发光模式测定结果，分别与GAPDH蛋白条带灰度比值作为半定量结果。为方便分析，对照组与GAPDH蛋白条带灰度比值转换为1，其余组等比例转换。

2 结 果

2.1 四组Ang-2蛋白表达水平比较 Western blot法检测Ang-2和αvβ1 siRNA腺病毒转染HUVECs对Ang-2表达水平的影响。结果显示空腺病毒转染HUVECs后，Ang-2表达水平较对照组无统计学差异(P>0.05)。Ang-2腺病毒转染HUVECs后，Ang-2表达水平较对照组明显升高(P<0.05)，说明Ang-2腺病毒转染有效，能促进HUVECs表达Ang-2。αvβ1 siRNA和Ang-2腺病毒共同转染HUVECs后，Ang-2表达水平较对照组明显升高(P<0.05)，但与Ang-2腺病毒转染组比较无统计学差异(P>0.05)，说明αvβ1 siRNA不影响Ang-2表达(图1)。

注：与NC组比较，*P<0.05

2.2 四组αvβ1蛋白表达水平比较 Western blot法检测Ang-2和αvβ1 siRNA腺病毒转染HUVECs对αvβ1蛋白表达水平的影响。结果显示空腺病毒转染HUVECs后，αvβ1表达水平较对照组无统计学差异(P>0.05)。Ang-2腺病毒转染HUVECs后，αvβ1表达水平较对照组无统计学差异(P>0.05)，说明Ang-2腺病毒转染HUVECs后能使Ang-2表达水平升高但不影响αvβ1水平。αvβ1 siRNA和Ang-2腺病毒共同转染HUVECs后，αvβ1表达水平较对照组明显下降(P<0.05)，说明αvβ1 siRNA腺病毒转染有效，能抑制HUVECs表达αvβ1(图2)。

注：与NC组比较，*P<0.05

2.3 四组MMP-2蛋白表达水平比较 Western Blot法检测Ang-2和αvβ1 siRNA腺病毒转染HUVECs对MMP-2表达水平的影响。结果显示空腺病毒转染HUVECs后，MMP-2表达水平较对照组无统计学差异(P>0.05)。Ang-2腺病毒转染HUVECs后，MMP-2表达水平较对照组明显升高(P<0.05)，说明Ang-2腺病毒转染后能促进HUVECs表达Ang-2的同时还能促进MMP-2表达。αvβ1 siRNA和Ang-2腺病毒转染HUVECs后，MMP-2蛋白表达水平较Ang-2腺病毒转染组明显下降(P<0.05)，说明αvβ1 siRNA腺病毒转染后低水平的αvβ1能抑制HUVECs表达MMP-2(图3)。

注：与NC组比较，*P<0.05；与Ad-Ang-2组比较，△P<0.05

3 讨 论

动脉粥样硬化作为冠心病发病的基础，其发生是多种因素参与的长期慢性过程，主要涉及血管内皮损伤、内皮下脂质沉积、炎性因子激活、单核细胞激活和迁移以及平滑肌细胞增殖和迁移等[5-6]。MMP-2作为基质金属蛋白酶家族的主要成员，其主要作用是降解细胞外基质，能够降解胶原、纤维蛋白和弹性蛋白，破坏基底膜，有利于脂质在内皮下沉积、单核细胞迁移至内皮下形成巨噬细胞，巨噬细胞内吞脂质形成泡沫细胞，同时各种生长因子刺激血管平滑肌细胞增殖，引起动脉粥样硬化斑块形成[7-8]。MMP-2还可以促进白介素、肿瘤坏死因子-α等炎症因子的释放，加重炎症反应，加速动脉粥样硬化斑块的形成[9]。由此可见MMP-2在促进动脉粥样硬化斑块形成过程中具有重要作用。MMP-2在动脉粥样硬化斑块的肩部区域表达明显增加，通过特异性分解Ⅳ型胶原，降解细胞外基质，能够降低斑块的稳定性，引起斑块破裂，导致急性冠脉综合征的发生[10-11]。因此，MMP-2能促进动脉粥样硬化斑块形成和降低斑块稳定性。

Ang-2是一种具有血管活性的因子，参与血管的新生到成熟，但其首先是在肿瘤细胞中发现，目前已在胃癌、肝癌、乳腺癌、胶质瘤、非小细胞肺癌等多种肿瘤组织中检测到Ang-2的存在，尤其是在许多恶性肿瘤组织中高表达，认为其具有促进肿瘤组织快速增殖、转移和侵袭的作用[12-13]。Hu等[14]首先通过分析大量人脑胶质瘤组织，发现肿瘤侵袭区域Ang-2表达量均明显升高，同时MMP-2的表达水平也明显增加，两者具有明显的相关性。体外实验发现Ang-2重组病毒质粒转染的胶质瘤细胞可引起MMP-2的表达量明显增加，同时肿瘤的侵袭能力也相应增强。相反，加入MMP-2抑制剂，能明显抑制肿瘤的侵袭。这些结果表明，Ang-2在诱导肿瘤细胞浸润中起着关键作用，并且这种作用可能是通过促进MMP-2的表达引起的。Hu等[4]随后通过人脑胶质瘤组织发现，Ang-2可能通过与整合素αvβ1结合促进MMP-2表达和分泌。

Ang-2除了在血管新生和肿瘤转移中起作用，还影响动脉粥样硬化斑块形成和稳定性[15-17]。Theelen等[18]通过高脂饮食构建动脉粥样硬化小鼠模型，腹腔注射Ang-2阻断性抗体来阻断Ang-2与其受体结合，从而抑制Ang-2的生理功能。结果发现Ang-2的生理作用被阻断后，小鼠甘油三酯水平明显降低，同时还能改善内皮细胞功能和抑制单核细胞迁移，认为Ang-2可促进动脉粥样硬化斑块的形成。Lee等[19]对126例急性冠脉综合征患者(82例急性心肌梗死和44例不稳定型心绞痛)外周血Ang-2水平进行了分析，并与40例稳定型心绞痛患者和40例健康对照者进行对比，结果显示急性冠脉综合征患者Ang-2水平明显增高，且急性心肌梗死患者升高更明显。Zeng等[20]通过研究也发现冠心病患者外周血Ang-2表达水平较健康人群明显升高，血浆Ang-2浓度与冠状动脉狭窄程度显著正相关，且冠状动脉介入治疗后血浆Ang-2浓度明显降低。我们前期对84例急性冠脉综合征患者(急性心肌梗死患者和不稳定型心绞痛患者各42例)、42例稳定型心绞痛患者和45名健康对照者血浆Ang-2和MMP-2浓度进行分析，发现急性冠脉综合征患者Ang-2和MMP-2水平均明显升高，急性心肌梗死患者升高更明显，且Ang-2与MMP-2水平呈显著的正相关[21]。

结合Ang-2和MMP-2在肿瘤中的作用，本研究进一步探讨内皮细胞Ang-2和MMP-2的相互作用关系。体外培养HUVECs，通过转染Ang-2腺病毒和αvβ1 siRNA腺病毒来调控Ang-2和αvβ1表达水平，观察对MMP-2表达的影响。结果显示Ang-2腺病毒转染HUVEC后能升高Ang-2水平，提示Ang-2腺病毒转染有效，还能促进MMP-2蛋白表达，但对整合素αvβ1无影响。当加入αvβ1 siRNA腺病毒抑制αvβ1表达后，MMP-2表达水平也明显下降。因此,本研究结果发现Ang-2能促进内皮细胞MMP-2的表达，可能通过与整合素αvβ1结合有关。