黄 峰 徐国超 金辰怡

种植牙是口腔临床比较常见的修复牙列缺损的方法，其成功有赖于良好的骨结合。目前，有很多的学者致力于骨结合的研究，如对植体表面改性，或应用生长因子等。然而，更合适的钛表面处理同时加载生长因子仍需进一步探索。纳米管表面能够显著增加成骨细胞的黏附力并与骨之间具有较强的结合力，且能够作为一些生长因子、药物以及抗菌剂的缓释载体而发挥它们的功能[1～5]。近些年的研究认为NGF与骨和关节愈合相关[6～11]。但加载方法大多采用注射法、渗透泵或者外部载体加载法，操作上较为繁琐且存在感染风险。那么如何应用合适的植体表面改性来加载NGF，保持其活性和作用非常重要。

本研究通过采用种植体表面制备的纳米管加载NGF，建立比格犬的下颌种植模型，观察载NGF纳米管对种植体界面骨愈合的影响。

材料与方法

1.实验动物：选取由浙大实验动物中心提供的6只比格犬。雄性，8月龄，体质量10～13kg。其饲养及手术均遵循浙江大学《实验动物伦理管理条例》。

2.制备纳米管结构，加载NGF并观察其释放情况：选择实验用纯钛种植体(浙江大学附属口腔医学院种植科提供)。植体消毒后，表面用400～2000目的砂纸进行抛光，并于超声震荡清洗，然后浸入0.5%氢氟酸溶液，进行阳极氧化。电压作用2h制备纳米管结构(R=30nm)。去离子水清洗，浸入鼠重组NGF溶液(浓度10mg/L，由北京舒泰神有限公司提供，国药准字S2060023，批号:20080101)。浸没时间设定24h，重复直到合适剂量的NGF均匀涂于表面。随后浸入pH 7.4的磷酸盐缓冲液中。每天取浸提液-70℃进行保存。加入等量磷酸盐缓冲液，分析NGF释放情况。

3.比格犬种植模型的建立与分组：比格犬于局部浸润麻醉下拔除双侧下颌第一、二前磨牙，同期植入种植体。于每颗前磨牙的远中拔牙窝植入种植体，在其近中制作3mm×3mm×3mm的缺损，双侧各植入2颗。于每只比格犬的左侧下颌骨植入2颗载NGF纳米管种植体作为实验组(共12例)。右侧下颌骨各植入1颗纳米管种植体和1颗未处理实验用种植体，分别作为对照组和空白组(各6例)。术后予抗生素应用3天。分别于植入4周和8周取样。

4.大体观察：种植术后每周观察种植体情况和比格犬状况。

6.组织学观察：种植体植入4周和8周取样，用现配的4%甲醛溶液固定，梯度脱水后浸入甲基丙烯酸甲酯单体，包埋、切片、磨片。行亚甲基蓝-酸性品红法染色。

8.统计学方法：采用SPSS 13.0统计学软件对数据进行统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.基本情况：实验的比格犬全部存活，术后创面愈合良好，未见红肿溢脓等。所有种植体均未脱落且稳定性良好。

2.ALP测定：术后4周实验组ALP活性略低，但差异无统计学意义。随着术后时间延长，ALP均降低。各组的ALP值降幅相近。术后8周，3组ALP活性均低于术后4周，成骨细胞的成骨能力趋于减弱，新骨已经开始矿化(表1)。

表1 术后4周和8周各组ALP活性检测(U×10-2/g湿重，

3.组织学观察：术后4周种植体表面可见散在分布的新生纤维组织，其间可见骨小梁结构。骨小梁联结成型，界面以骨性连接为主，新生骨以骨组织面向种植体表面进行生长。新生骨小梁(红粉色)表面存在许多类骨质(亮蓝色)。术后8周可见种植体界面大面积由新生骨质覆盖，新生骨出现明显矿化，其程度高于种植体植入4周时的表现。3组种植体界面的新骨均出现矿化，其中以实验组较明显，后两组新生骨略少且矿化也略低(图1)。

图1 各组种植-骨界面组织学观察亚甲基蓝-酸性品红,×40

4.种植体骨结合率：术后4周，种植体骨结合率实验组显著高于另两组(P<0.05)。术后8周，实验组略高于另两组(P>0.05，表2)。

表2 术后4周和8周各组种植体骨结合率

讨 论

即刻种植是指拔牙同期进行种植。目前它在口腔临床中已广泛应用。对于牙列缺损或牙列缺失的患者来说，即刻种植能够立即改善美观，帮助恢复发音和咀嚼功能，同时恢复面部形貌，是目前最佳的治疗方案。如何促进即刻种植的早期骨结合是研究者的关注点。研究发现种植体表面形貌的改变能够获得更好的早期骨结合，种植体表面的纳米管结构能够促进成骨细胞的成熟，从而促进骨结合[14～16]。此外，纳米管结构还能作为一些生物因子、药物和抗菌剂的缓释载体[1,5]。

NGF能够刺激成骨相关细胞的成骨能力[17]。有研究者应用NGF后发现ALP含量升高，成骨细胞数量增加，成骨活性增强[18]。本研究中，随着植入时间延长，植体界面的骨发生变化，ALP出现下降。说明在新骨沉积时，成骨细胞能力减弱。其中实验组ALP活性较对照组和空白组偏低，说明NGF促进了新生骨的矿化和成熟，缩短了骨愈合所需的时间。

NGF能够促进骨生长。近年来研究表明，NGF可通过改变成骨相关细胞的能力，促进成骨增强从而促进骨组织的愈合和种植体的骨结合[19～21]。骨结合中，新生血管非常关键。已有的研究认为NGF能促进新生血管形成，从而促进种植体的骨结合[22，23]。本研究组前期通过研究比格犬种植，也发现NGF能够促进早期骨结合。通过建立兔的种植模型，发现注射NGF能促进种植体四周新骨生成。日本研究者也通过研究发现，通过渗透泵载NGF的种植体不但能够促进下牙槽神经的功能再生，同时能够促进种植体的骨结合[24]。但不管是利用明胶海绵加载法、局部注射亦或是渗透泵法，操作上容易出现感染或者比较烦复。因而本实验中笔者利用种植体表面制备的纳米管加载NGF，观察种植体界面的骨质情况。结果发现术后4周，界面以新生骨连接，其中种植体与新骨的接触面积以实验组稍高。术后8周，各组新生骨出现矿化，其中实验组较明显。表明NGF能够促进种植体界面骨愈合，纳米管能够作为NGF很好的载体发挥其功能。

综上所述，载NGF纳米管结构能够促进种植体界面的早期骨愈合，促进新骨沉积矿化，缩短骨愈合时间，有利于种植体骨结合。