刘汝婷，张 倩，郭西鹏，王金华，高 娃*

（湖北工业大学 生物工程与食品学院 发酵工程教育部重点实验室，湖北 武汉 430068）

L-乳酸是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、医药和化工等领域。作为可生物降解的新材料——聚乳酸（polylactic acid，PLA）的主要原料，L-乳酸已经成为目前最重要的有机酸之一[1-2]。由于其居高不下的生产成本，难以在价格上与传统的塑料相竞争[3-4]。

我国是农产品种植大国，每年产生的农作物秸秆还有其他农作物废弃物较多[5]。数量巨大的小麦秸秆尚未进行大规模有效的利用与开发，多采用焚烧处理造成环境污染，利用这些廉价的小麦秸秆可以代替粮食生产乳酸[6-7]。木质纤维素经过各种处理后，其水解液包含大量的葡萄糖和木糖[8-11]。因碳代谢阻遏效应（carbon catabolite repression，CRR）[12-13]，即葡萄糖的存在会抑制其他糖的代谢，致使大肠杆菌（Escherichia coli）优先利用葡萄糖，葡萄糖耗尽后才可利用其他糖类[14-15]，绝大多数的微生物无法利用水解液中的木糖。

为解除在利用木糖时存在的碳代谢阻遏效应，有研究表明，可以通过基因工程技术对微生物进行改造[16]，该阻遏效应与磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶（phosphoenolpyruvate-sugarphos photransferase，PTS）系统密切相关[17]。PTS系统主要负责特异性地转运葡萄糖，同时将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸，进入糖酵解过程[18]。有研究报道，敲除PTS系统中的葡萄糖转运酶基因ptsG来降低碳代谢阻遏效应，进而提高木糖的利用程度，提高糖酸转化效率；半乳糖的相关转运系统也可以转运葡萄糖，通过敲除半乳糖转运基因mglB，也可降低碳代谢阻遏效应，使重组大肠杆菌能够同时利用葡萄糖和木糖[19]，如丁小云等[20]构建的葡萄糖转运酶基因ptsG缺失乳酸工程菌可同时利用葡萄糖和木糖发酵产D-乳酸，产量为83.04 g/L；江吉雄[21]通过敲除半乳糖转运基因mglB，降低了混合糖发酵D-乳酸中的葡萄糖效应，使发酵周期缩短了约40%，转化率提高了2.3%；许琼丹等[18]通过敲除mglB基因，降低了混合糖发酵乙醇中的葡萄糖效应，使发酵周期缩短了约36%，转化率提高了5.8%。

本研究以可高效利用葡萄糖产L-乳酸的大肠杆菌（E.coli）JH16为出发菌株，通过Red同源重组技术构建ptsG/mglB双基因缺陷菌株JH2705，以减弱葡萄糖效应，提高混合糖中木糖的利用率，为基于木质纤维素等可再生原料高效生产L-乳酸提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株与质粒

本研究所用的菌株和质粒见表1。

表1 本研究所用的菌株和质粒Table 1 Stains and plasmids used in this study

1.1.2 试剂

CaCl2·2H2O、L-阿拉伯糖（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；DL5 000脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix：美国Fermentas公司；10×TE溶液、氨苄青霉素、卡那霉素（纯度均为99%）：法国Mersco公司；PCR引物：上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.1.3 培养基

LB液体培养基[16]：1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉，0.5%NaCl。LB固体培养基在LB液体培养基中添加1.5%～2%琼脂粉。

抗性筛选培养基[16]：LB固体培养基中添加50 μg/mL氨苄青霉素或卡那霉素。

种子培养基[16]：LB液体培养基中加入20 g/L葡萄糖或木糖。

发酵培养基[16]：LB液体培养基加入56 g/L葡萄糖和24 g/L木糖。

上述培养基均在121 ℃条件下灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

MicroPluser电转仪、My Cycler PCR仪：美国Bio-Red公司；Waters e2695型高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：美国Waters公司；Sartorius BB-8846880发酵罐：德国Sartorius Stedim Biotech公司。

1.3 方法

1.3.1 PCR引物设计

根据ptsG和mglB基因序列设计敲除引物分别为△ptsGP1、△ptsG-P2、△mglB-P1、△mglB-P2，结果见表2。该对引物5'端碱基长度为45 bp的基因片段与ptsG和mglB基因序列同源，以18～20 bp（表中下划线序列）与质粒pkD4上FRT-kan-FRT阅读框序列同源。

表2 本研究所用引物Table 2 Primes used in the study

1.3.2ptsG/mglB双基因敲除大肠杆菌的构建

以质粒pkD4为模板，△ptsG-P1、△ptsG-P1为引物进行PCR扩增得到带有卡那霉素抗性基因的PCR扩增产物。PCR扩增条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循环30次。

采用CaCl2法[22]将质粒pkD46转化入E.coliJH16的细胞中，通过氨苄青霉素抗性筛选培养基上筛选得到阳性单菌落。将阳性单菌落接种于含有1.6%L-阿拉伯糖的LB培养基中，30 ℃条件下培养至OD600nm值=0.3～0.6，冰水浴30 min后，用去离子水洗涤4次后得到感受态细胞E.coliJH16/pkD46。

采用电转法[19]将PCR扩增产物转化到感受态细胞E.coliJH16/pkD46中，涂布到卡那霉素抗性筛选培养基上。在37 ℃培养箱中培养24 h，挑选生长良好的阳性单克隆在卡那霉素抗性筛选培养基上转接1～2代，并用鉴定引物△ptsG-P3、△ptsG-P4进行PCR验证。将成功敲除ptsG基因的E.coliJH16命名为E.coliJH17。

敲除mglB基因方法与敲除ptsG基因方法相同。将成功敲除mglB基因的E.coliJH17命名为E.coliJH2705。

1.3.3 发酵摇瓶培养

挑取E.coliJH2705单菌落接种于LB液体培养基中，装液量为100 mL/250 mL，37 ℃、200 r/min条件下培养至OD600nm值至1.0～1.2左右，作为种子液。按2%（V/V）的接种量将种子液接种于发酵培养基中，装液量为100 mL/250 mL，37 ℃、200 r/min条件下培养，定时取样，测定菌体浓度光密度值（OD600nm值）、葡萄糖、木糖残留量及乳酸产量，每个处理作三个平行。

1.3.4 发酵罐发酵培养

一级种子液培养：挑取E.coliJH2705单菌落接种于LB液体培养基中，装液量为50 mL/250 mL，37 ℃、100 r/min条件下培养12 h。二级种子液培养：取20 mL一级种子液接种于LB液体培养基中，装液量为400 mL/1 L，37 ℃、150 r/min条件下培养到OD600nm值为1.0左右。将培养好的二级种子液按10%（V/V）的接种量接种至发酵培养基中，装液量为4 L/7 L发酵罐，37 ℃、200 r/min条件下发酵72 h，发酵过程中采用3 mol/L的Ca（OH）2作为中和剂控制发酵液pH值为7.0。定时取样，测定菌体浓度OD600nm值、葡萄糖、木糖残留量及L-乳酸产量。

1.3.5 分析检测

菌体浓度OD600nm值：采用紫外分光光度计在波长600 nm处测定菌液的吸光度值；葡萄糖、L-乳酸含量：采用生物传感仪检测法测定[23]；木糖含量：采用高效液相色谱分析[19]。

2 结果与分析

2.1 重组菌大肠杆菌JH2705的构建结果

以鉴定引物△ptsG-P3和△ptsG-P4、△mglB-P3、△mglBP4对磷酸转移酶系统中的葡萄糖转运酶基因ptsG（碱基长度为950 bp）和半乳糖转运基因mglB（碱基长度为910 bp）的敲除结果进行验证，结果见图1。由图1可知，E.coliJH16经过菌落PCR扩增后，出现碱基长度分别为950 bp和910 bp的基因片段，而敲除这两个基因后的重组菌E.coliJH2705经菌落PCR扩增后，无ptsG、mglB基因片段，说明重组菌E.coliJH2705中的ptsG、mglB基因已经成功被敲除。

图1 ptsG/mglB基因缺陷菌株Escherichia coli JH2705的PCR鉴定结果Fig.1 PCR identification result of ptsG and mglB genes deficient Escherichia coli JH2705

2.2 摇瓶发酵试验结果

以小麦秸秆为代表的木质纤维素水解液中，由纤维素水解得到葡萄糖约为60%，且半纤维素与木糖比大约为7∶3[24]，因此，本研究模拟小麦秸秆水解液组成，设定5.6%葡萄糖与2.4%木糖为发酵碳源，不同菌株对混合糖的发酵效果见表3。由表3可知，E.coliJH16、E.coliJH17、E.coliJH2705三菌株在72 h内可发酵完毕，与出发菌E.coliJH16相比，E.coliJH2705的葡萄糖残糖量（18.7 g/L）增加，葡萄糖消耗速率（0.52 g/（L·h））降低33.3%，无木糖残留，木糖消耗速率（0.36 g/（L·h））升高38.5%，乳酸生产强度（0.56 g/（L·h））提高33.3%。说明敲除ptsG和mglB基因后，碳代谢阻遏效应减弱，提高木糖消耗速率。

表3 Escherichia coli JH16、JH17、JH2705对混合糖发酵结果Table 3 Mixed sugar fermentation results of Escherichia coli JH16,JH17 and JH2705

2.3 发酵罐发酵试验结果

2.3.1 生长曲线

E.coliJH16、E.coliJH17、E.coliJH2705在7 L发酵罐中发酵利用混合糖时的生长情况见图2。由图2可知，E.coliJH16、E.coliJH17及E.coliJH2705分别在发酵24 h、28 h、32 h时，OD600nm值达到最大（7.1、7.4、8.4）后进入稳定期。与E.coliJH16相比，E.coliJH17和E.coliJH2705的菌体生长更为明显，表明敲除基因后的两菌株可以摄取更多的碳源用于菌体生长[25]。

图2 Escherichia coli JH16、JH17及JH2705发酵利用混合糖时的生长曲线Fig.2 Growth curves of Escherichia coli JH16,JH17 and JH2705 in fermentation with mixed sugars

2.2.2 葡萄糖和木糖消耗曲线

E.coliJH16、E.coliJH17及E.coliJH2705在7 L发酵罐中发酵利用混合糖时葡萄糖及木糖的消耗情况见图3。由图3可知，E.coliJH2705同时开始利用葡萄糖和木糖，发酵40 h时木糖消耗完毕，发酵至44 h时葡萄糖消耗完毕，而E.coliJH16优先利用葡萄糖，发酵28 h时葡萄糖利用完毕，发酵30 h时开始利用木糖，至52 h还剩余7.1 g/L未被利用；E.coliJH17同时利用葡萄糖和木糖，发酵44 h时葡萄糖利用完毕，发酵至52 h时木糖剩余量为3.1 g/L。E.coliJH16、E.coliJH17、E.coliJH2705消耗葡萄糖的速率分别为2.01 g/（L·h）、1.28g/（L·h）、1.20g/（L·h），消耗木糖速率分别为0.33 g/（L·h）、0.40 g/（L·h）、0.60 g/（L·h）。结果表明，ptsG基因的缺失，可有效降低分解代谢阻遏效应，使得葡萄糖消耗速率降低，木糖消耗速率升高。而ptsG、mglB基因双缺陷菌E.coliJH2705的木糖消耗速率比ptsG基因缺陷菌E.coliJH17提高50%，表明两个基因对木糖利用效率升高具有叠加效应。

图3 Escherichia coli JH16、JH17及JH2705发酵利用混合糖时木糖和葡萄糖消耗曲线Fig.3 Curves of xylose and glucose consumption in Escherichia coli JH16,JH17 and JH2705 fermentation with mixed sugars

2.2.3L-乳酸产量

E.coliJH16、E.coliJH17、E.coliJH2705的L-乳酸产量见图4。由图4可知，在发酵16 h之前，E.coliJH16的L-乳酸产量高于E.coliJH17、E.coliJH2705，E.coliJH17、E.coliJH2705同时利用葡萄糖和木糖产L-乳酸，但利用木糖的速率较慢，而E.coliJH16虽然不能利用木糖，但其利用葡萄糖产L-乳酸的速率却大于E.coliJH17、E.coliJH2705利用葡萄糖和木糖产L-乳酸的速率之和；在发酵18 h后，E.coliJH17和E.coliJH2705的L-乳酸产量逐渐超过E.coliJH16，E.coliJH17和E.coliJH2705利用木糖产L-乳酸的能力远大于E.coliJH16。发酵至48 h时，E.coliJH16的L-乳酸产量为34.12 g/L，转化率为42.0%，生产强度为0.71 g/（L·h）；E.coliJH17的L-乳酸产量为53.22 g/L，转化率为66.5%，生产强度为1.02 g/（L·h）；E.coliJH2705的L-乳酸产量为56.03 g/L，转化率为70.0%，生产强度为1.27 g/（L·h）。与出发菌株E.coliJH16相比，重组菌株E.coliJH17、JH2705生产强度分别提高了43.9%、79.1%。重组菌株E.coliJH2705已消耗完所有碳源，而E.coliJH17、JH16分别剩余3.1 g/L、7.1 g/L的木糖。结果表明，敲除ptsG和mglB基因后，菌株的生产强度提高。

图4 Escherichia coli JH16、JH17及JH2705发酵混合糖产L-乳酸含量Fig.4 Contents of L-lactic acid produced by Escherichia coli JH16,JH17 and JH2705 fermented with mixed sugars

3 结论

本研究以大肠杆菌JH16为出发菌株，通过Red同源重组技术，同时敲除了磷酸转移酶系统中的葡萄糖转运酶基因ptsG和半乳糖转运基因mglB，构建ptsG/mglB双基因缺陷型大肠杆菌JH2705。该菌株以8%混合糖（5.6%葡萄糖+2.4%木糖）为碳源发酵产L-乳酸时，能同时利用葡萄糖和木糖，大幅度减小了葡萄糖效应所带来的不利影响，其木糖利用速率为0.60 g/（L·h），L-乳酸生产强度为1.27 g/（L·h），较出发菌株E.coliJH16分别提高50%、79.1%，并且E.coliJH2705的糖酸转化率高达70%，为木质纤维度高效利用木糖提供一定的理论基础。