李 敏，江泽斌，郑付春

(汕头大学医学院第一附属医院，广东 汕头 515041)

微RNA(miRNA)是一类内源性的非编码小RNA分子，也是最大的基因家族之一[1]。1993年，第一个miRNA lin-4被发现参与线虫发育的调控[2]，随后的20年间，成千上万种miRNAs在动植物以及人体内被相继发现。miRNA的产生主要分为两个阶段：miRNA初级转录产物在细胞核中被核糖核酸酶Drosha处理成一个约70个核苷酸长度的前体mRNA；之后在转运蛋白exportin-5的作用下被转移到胞质内，进而被Dicer酶切割成长约22个核苷酸的成熟miRNA。成熟miRNA可以与细胞内的Argonaute蛋白等结合形成miRNA诱导的沉默复合体，与靶基因的3′-UTR区域特异性结合，引起靶基因mRNA的降解或翻译抑制。人体中的miRNAs参与约30%基因的表达调控，与整个生命活动密切相关[3]。多个miRNA能同时调控同一个代谢酶，一个miRNA也能同时调控多种代谢酶。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(uridine diphosphate-glucuronyl transferase，UGT)是一类重要的Ⅱ相代谢酶，可以在内源物和外源物分子上加入一个葡萄糖醛酸基团，增加极性，利于其经尿液与胆汁排泄，从而调节体内稳态。UGT2B7是UGT家族中重要的一员。本课题组前期研究发现，miR-376b-3p与癫痫患者丙戊酸钠血药浓度有相关性，从丙戊酸钠的代谢酶中筛选出UGT2B7能被miR-376b-3p调控，且UGT2B7在丙戊酸钠的主要代谢途径中所占比例最高。本研究探讨miR-376b-3p对HepG2细胞UGT2B7的调控作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

HepG2细胞(广州赛库生物技术有限公司)，HEK293T细胞由牛永东老师馈赠，miR-376b-3p模拟物及阴性对照、miR-376b-3p抑制剂及阴性对照(上海诚鑫生物科技有限公司)，UGT2B7抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)，GAPDH抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，qPCR试剂盒(宝日医生物技术有限公司)，双荧光素酶报告基因检测试剂盒(广州致邦生物科技有限公司)，UGT2B7 3′-UTR野生型(WT)以及突变体(Mut)质粒、miR-376b-3p质粒、海肾荧光素酶报告基因质粒(上海吉凯基因科技有限公司)，DMEM、胎牛血清、胰酶、青霉素—链霉素双抗溶液(美国Hyclone公司)，ABI QS5荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，报告基因检测仪(美国PROMEGA公司)。

1.2 方法

1.2.1 双荧光素酶报告基因分析实验分组为miR-376b-3p阴性对照+UGT2B7 3′-UTR WT组、miR-376b-3p+UGT2B7 3′-UTR WT 组、miR-376b-3p阴性对照+UGT2B7 3′-UTR Mut组、miR-376b-3p+UGT2B7 3′-UTR Mut组、miR-376b-3p阴性对照+UGT2B7 3′-UTR WT阴性对照组、miR-376b-3p+UGT2B7 3′-UTR WT阴性对照组(WT阴性对照也为Mut阴性对照)。将融合度为70%～80%的HEK293T细胞用胰酶消化后进行细胞计数，按2×104个细胞/孔接种于白色96孔板，培养16～24 h后；每孔转染25 ng WT/Mut质粒，5 ng海肾荧光素酶报告基因质粒，100 ng miR-376b-3p质粒或miR-376b-3p阴性对照质粒；转染48 h后，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒分别检测萤火虫荧光素的荧光强度和海肾荧光素的荧光强度，以萤火虫与海肾荧光素荧光强度的比值作为结果进行统计。

1.2.2 实时PCR检测HepG2细胞中UGT2B7的mRNA水平HepG2细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃、5%CO2的恒温培养箱中进行传代培养。使用miR-376b-3p模拟物或miR-376b-3p抑制剂以及阴性对照(30 nmol/L)与5 μL Lipofectamine RNAiMAX转染试剂形成脂质体复合物，再用无抗生素的培养基稀释细胞(1×105～3×105个/mL)加入六孔板中，培养36 h后，使用Trizol裂解液进行总RNA提取。PCR反应条件：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，34 s，40个循环，以β-actin作为内参基因检测UGT2B7 mRNA的表达水平。

1.2.3 蛋白印迹法检测HepG2细胞中UGT2B7的蛋白水平在六孔板中转染miR-376b-3p模拟物或miR-376b-3p抑制剂以及阴性对照48 h后，使用PBS缓冲液洗3次，每孔加入50 μL裂解液，冰上裂解30 min，随后12 000 r/min，4℃离心，收集上清液。采用BCA法蛋白定量，完成后将蛋白在沸水中变性5 min，冷却后待使用。将蛋白样本进行SDS-PAGE凝胶电泳，采用12%的分离胶，上样量10 μg，电泳90 min，随后采用湿转法将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜，转膜时间为90 min，再将条带置于5%脱脂牛奶中封闭1 h，封闭结束后在4℃条件下孵育一抗过夜(UGT2B7抗体稀释比例为1∶2 000，GAPDH抗体稀释比例为1∶5 000)；第2天在室温下孵育二抗1 h(UGT2B7 1∶40 000稀释，GAPDH 1∶100 000稀释)，加入发光液，在暗室中曝光，Gel-pro图像分析软件分析蛋白条带的灰度值。

1.3 统计学分析

应用GraphPad Prism 6软件进行分析，符合正态分布的计量资料以xˉ±s表示，2组间比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-376b-3p与UGT2B7 mRNA的结合

结合位点如图1A所示，miR-376b-3p与UGT2B7 3′-UTR的结合位点具有广泛的种子配对且第1位核苷酸是A，在第16～20位也有结合。双荧光素酶质粒突变位点如图1B所示。在HEK293T细胞中通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-376b-3p能否与UGT2B7 3′-UTR直接结合。如图1C所示，与miR-376b-3p阴性对照组相比，共转染miR-376b-3p与UGT2B7 3′-UTR WT组的荧光素酶活性降低13%，差异具有统计学意义(P＜0.05)，共转染 UGT2B7 3′-UTR Mut组的荧光素酶活性差异无统计学意义(P＞0.05)。

图1 miR-376b-3p与UGT2B7 mRNA的结合

2.2 miR-376b-3p对UGT2B7 mRNA的调控

如图2所示，与阴性对照组相比，miR-376b-3p模拟物组UGT2B7 mRNA水平下降44%，miR-376b-3p抑制剂组UGT2B7 mRNA水平升高41%，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

图2 miR-376b-3p模拟物和抑制剂对UGT2B7 mRNA表达的影响

2.3 miR-376b-3p对UGT2B7蛋白表达的调控

如图3和图4所示，与阴性对照组相比，miR-376b-3p模拟物组UGT2B7蛋白表达下降34%，miR-376b-3p抑制剂组蛋白表达升高67%，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。肝药酶抑制剂双氯芬酸和肝药酶诱导剂利福平作为免疫印迹法的阳性药。

图3 miR-376b-3p模拟物对UGT2B7蛋白表达的影响

图4 miR-376b-3p抑制剂对UGT2B7蛋白表达的影响

3 讨论

UGT广泛分布在肝脏、肾脏、心脏、脑、皮肤等器官和组织中，其中在肝脏中活性最高，是生物体内外源性物质进行Ⅱ相生物转化主要的代谢酶。UGT参与约35%临床用药的代谢，35%被UGT代谢的临床用药是UGT2B7的底物[4]。UGT2B7在肝脏中高表达，对各种内源性化合物包括胆汁酸、视黄酸、类固醇、盐皮质激素、糖皮质激素、脂肪酸，以及外源性化合物包括致癌物质，治疗药物如吗啡、可待因[5]、盐酸表柔比星[6]、丙戊酸[7]，及非甾体类抗炎药具有高活性。迄今为止，人们已经利用肝癌细胞系、人原代肝细胞和转基因小鼠等肝脏模型对UGT2B7的转录调控进行了深入研究[8]。已发现参与调控UGT2B7表达的转录因子包括肝细胞的核因子1α[9]、HNF4α、尾相关同源框因子2[10]、红细胞来源核转录因子Nrf2、核内X受体[11]、p53[12]和激活蛋白1[13]。随着对miRNA研究的不断深入，已经证实miRNA不但在生理过程中发挥重要作用，而且在肿瘤发生和药物代谢过程中也发挥重要的调控作用。miRNA可以直接调控药物代谢酶UGT2B7的表达，也可以通过调控转录因子而间接调控UGT2B7的表达。尽管UGT2B7的转录因子调控机制已得到充分研究，但它如何被miRNA调控还鲜有报道。

miRNA通常通过mRNA降解或翻译抑制来抑制基因表达，具体作用机制取决于miRNA和靶mRNA之间序列互补的程度和性质。本研究miR-376b-3p与UGT2B7 3′-UTR的结合位点具有广泛的种子配对且第一位核苷酸是A，在第16～20位也有结合，这更有利于向mRNA降解途径发展。本研究利用双荧光素酶表明miR-376b-3p通过UGT2B7 3′-UTR的一个结合位点对UGT2B7进行负调控。HepG2细胞癌性较低，有较完整的Ⅰ、Ⅱ相代谢酶的表达。本研究在HepG2细胞中转染miR-376b-3p模拟物，UGT2B7 mRNA水平降低44%，转染miR-376b-3p抑制剂，UGT2B7 mRNA水平升高41%，在蛋白水平上，转染miR-376b-3p模拟物使UGT2B7蛋白水平下降34%，转染miR-376b-3p抑制剂能使UGT2B7蛋白水平升高67%。这表明miR-376b-3p在UGT2B7 mRNA水平和蛋白表达水平上都有抑制作用。

综上所述，miR-376b-3p能通过结合UGT2B7 3′-UTR负调控UGT2B7的mRNA和蛋白表达。miR-376b-3p可能通过调控UGT2B7，进而影响丙戊酸钠的血药浓度，这或许是丙戊酸钠个体差异性较大的部分原因。