胡栋宝，杜薇，杨猛

(玉溪师范学院 化学生物与环境学院, 云南 玉溪 653100)

巨大口蘑(Tricholomagiganteum)，别名大口蘑、大白口蘑等，是一种珍稀的大型食用菌[1]。其子实体营养丰富、味道鲜美,具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、抑制高血压、抑制细菌等多种生理功能[2-3]。研究表明巨大口蘑子实体含有多糖、多酚、蛋白质、脂肪、灰分、粗纤维及多种微量元素。巨大口蘑是一种高品位的食用菌与保健食品，常被添加在保健食品或者调味品中来提高食品的营养价值，如梁大伟等将巨大口蘑粉添加在饼干中制成了营养价值高的食品，适用于现代化工厂化生产，具有广阔的市场前景[4]。真菌多糖是一类可以控制细胞分裂和调节细胞生长和衰老的活性多糖，具有明显的抗菌、降血糖、抗氧化、降血脂等作用。目前，有关响应曲面法优化巨大口蘑多糖提取工艺及抗氧化活性的研究尚未见文献报道，为了充分利用该食用菌资源，本研究利用超声波辅助提取响应面优化法获取多糖提取的最佳工艺条件，在此基础上，利用DPPH自由基清除等试验研究巨大口蘑多糖提取物的抗氧化活性，将为巨大口蘑食用菌资源的开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

巨大口蘑：采自云南省普洱市；葡萄糖、乙醇、浓硫酸、苯酚、过硫酸钾：四川西陇化工有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：美国Sigma公司；2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、抗坏血酸：均为国产分析纯，天津市双船化学试剂厂。

UV-2700紫外分光光度计 日本岛津公司；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵 河南巩义市予华仪器有限公司；超声仪 上海声源超声波仪器设备有限公司；台式高速离心机 湖南可成仪器设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 多糖的提取工艺

准确称取0.5000 g巨大口蘑粉末，采用经典的水提醇沉法[5]，加入一定体积的蒸馏水进行超声波提取，提取2次，然后进行抽滤，合并滤液，在滤液中加入3倍体积的95%乙醇于4 ℃的冰箱中放置12 h进行醇沉，然后进行离心,得到多糖沉淀，用蒸馏水进行复溶并定容至25 mL，得到多糖溶液。

1.2.2 单因素试验

1.2.2.1 液料比对多糖提取率的影响

固定反应条件为超声时间30 min、超声提取次数2次时，考察不同液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1，mL/g)对巨大口蘑多糖得率的影响。

1.2.2.2 提取时间对多糖提取率的影响

固定反应条件为液料比为25∶1、提取2次时，考察不同超声时间(10，20，30，40，50，60 min)对其多糖得率的影响。

1.2.2.3 提取时间对多糖提取率的影响

固定反应条件为液料比25∶1、超声时间40 min时，考察巨大口蘑提取1，2，3次时对其多糖得率的影响。

1.2.3 响应面试验

用Design Expert 8.0.6软件并在上述单因素试验基础上设计响应面优化试验，将3个因素作为变量来探究它们对巨大口蘑多糖得率的影响，见表1。

表1 响应面试验因素水平及编码Table 1 The factors and levels of response surface test

1.2.4 多糖得率的计算

1.2.4.1 葡萄糖标准曲线的制作

将100 mg葡萄糖用100 mL的蒸馏水溶解配成质量浓度为1.0 mg/mL葡萄糖溶液，取10.00 mL上述溶液稀释成0.1 mg/mL，分别移取0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20 mL浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖溶液，每份加蒸馏水到2.0 mL,加5%的苯酚溶液1.00 mL，加浓硫酸溶液5.00 mL，于阴暗处放置30 min，在波长490 nm处测定吸光度值，平行3次，绘制标准曲线,所得方程为y=45.114x-0.0101,相关系数R2=0.9994，拟合程度较好。

1.2.4.2 多糖的测定及得率的计算

(1)

式中：W为多糖得率，%；c为提取液中多糖的含量，mg/mL；V1为比色液体积，mL；V2为定容体积,mL；V3为供试样品体积,mL；m为试验样品质量,mg。

1.2.5 巨大口蘑多糖的抗氧化试验

1.2.5.1 多糖对DDPH自由基的清除率

取两份不同浓度的巨大口蘑多糖溶液(0.01，0.02，0.03，0.04 mg/mL)于比色管中，分别加入2.00 mL DPPH溶液和2.00 mL 95%乙醇溶液混合均匀，室温静置30 min，以含95%乙醇的样品溶液为空白对照，在517 nm处测定Ai和Aj的吸光度；以95%乙醇替代不同体积的多糖溶液，测吸光度Ac，以Vc做阳性对照，平行3次试验。

计算DPPH自由基清除率[6]，公式如下：

DPPH自由基清除率/%=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100。

(2)

1.2.5.2 多糖对ABTS+自由基的清除率

移取2.00 mL不同质量浓度(0.01，0.02，0.03，0.04 mg/mL)的巨大口蘑多糖溶液，加入4.00 mL预混合的ABTS溶液摇匀,室温下放置10 min，在波长为734 nm处测吸光度Ai, 将巨大口蘑多糖溶液换成无水乙醇加入ABTS测得Ac，无水乙醇代替ABTS加入巨大口蘑多糖溶液测得Aj，平行3次试验，以Vc做阳性对照，由公式计算ABTS+自由基清除率[7]：

ABTS+自由基清除率/%=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100。

(3)

1.2.5.3 多糖的还原力

分别加入2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸缓冲溶液和浓度分别为0.01，0.02，0.03，0.04 mg/mL的多糖溶液1.00 mL和2.5 mL 1%铁氰化钾，于50 ℃反应20 min，冷却后依次加入2.50 mL 10%三氯乙酸停止反应，离心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL FeCl3，混合均匀放置10 min,在700 nm处测吸光度，平行3次，以Vc作为阳性对照。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 液料比

固定超声时间为30 min，超声提取次数2次，考察不同液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1，mL/g)对多糖得率的影响，试验结果见图1。

图1 液料比对多糖提取率的影响Fig.1 The effect of liquid-solid ratio on extraction rate of polysaccharides

由图1可知，当液料比在5∶1～25∶1的范围内，多糖提取率呈上升的趋势，并且在25∶1时达到峰值，在30∶1～40∶1时其得率逐渐下降，可能是由于增加提取液体积有利于增大其与浸提物的接触面积，使多糖能够较多溶出，当提取液达到一定体积时多糖溶出会达到饱和，多糖得率会趋于平稳或者缓慢下降[8]。因此，最佳液料比选为25∶1。

2.1.2 超声时间

确定液料比为25∶1、提取2次的条件下，研究不同超声时间(10，20，30，40，50，60 min)对巨大口蘑多糖得率的影响，试验结果见图2。

图2 超声时间对多糖提取率的影响Fig.2 The effect of ultrasonic time on extraction rate of polysaccharides

由图2可知，当超声时间在10～40 min内，多糖得率逐步增加，一旦超过40 min其得率开始连续下降，可能原因是超声时间太短，多糖不能充分溶出，达到最大提取率后含量大幅降低。因此，最佳超声时间为40 min。

2.1.3 超声提取次数

确定液料比为25∶1、超声时间为40 min的前提下，研究巨大口蘑提取1，2，3次时对巨大口蘑多糖得率的影响，试验结果见图3。

图3 超声提取次数对多糖提取率的影响Fig.3 The effect of ultrasonic extraction times on extraction rate of polysaccharides

由图3可知，当提取次数为2次时其得率达到最高，之后得率开始急剧下降，可见超声提取次数对巨大口蘑多糖得率有很大的影响。因此，此试验最佳的提取次数为2次。

2.2 响应面优化试验

根据表2中的三因素三水平生成17组试验，验证得到其条件下所对应的多糖得率[9-10]，结果见表2。得到回归方程：Y=4.45+0.031A+0.041B+0.065C-7.500E-003AB+1.000E-002AC-0.030BC-0.83A2-0.35B2-0.20C2,该模型的R2=0.9960,校正系数RAdj2=0.9910。

表2 响应曲面设计及结果Table 2 Response surface design and results

2.3 响应面交互作用分析试验

通过Design-Expert 8.0软件设计出的试验方案作出响等高线图和响应面图，见图4。

图4 不同影响因素交互作用的响应面图和等高线图Fig.4 Response surface and contour plots of the interaction of different influencing factors

由表3可知，模型的P<0.0001显著性表现为非常显著，失拟残差项P=0.9276>0.05，表现为不显著[11]。因此，该模型可应用于巨大口蘑多糖提取试验的预测。在方差分析表中用F值来衡量该因素对提取率的影响，F值越大其影响程度也越明显，P值越小其影响程度越明显[12-13]。在一次项A，B，C 3个影响因素中发现C因素的F=15.24最大, 可见其对试验的影响极显著,B，A次之。二次项中A2极显著,B2、C2显著。响应面图中越陡峭则显示该因素对其影响越明显，反之，越平坦则影响不明显。等高线图可以依据其图形的形状来判断其交互影响的程度，若图形为椭圆则交互现象越明显[14-15]。

表3 方差分析表Table 3 The analysis of variance

2.4 优化与验证试验

依据以上响应面试验模型和结果分析，得出最佳提取条件下巨大口蘑多糖的提取率为4.28452%，应用至实际中(液料比27∶1(mL/g)、超声时间40 min、超声提取次数2次)，此时巨大口蘑多糖的得率是3.96%。该优化试验结论准确可靠，在此基础上继续后续的抗氧化试验。

2.5 巨大口蘑多糖体外抗氧化活性评价

由图5～图7可知，DPPH、ABTS+的清除作用随着巨大口蘑多糖溶液质量浓度的增加而逐渐加强并逐步接近Vc的清除作用，呈现出一定的线性关系。在浓度为0.04 mg/mL时，巨大口蘑多糖提取液对DPPH、ABTS+自由基具有强的清除活性, 清除率达80%。由图7可知，巨大口蘑多糖溶液同时也具有一定的还原能力，它也随着巨大口蘑多糖质量浓度的增加而增加。

图5 多糖清除DPPH自由基能力Fig.5 The DPPH free radical scavenging ability of polysaccharides

图6 多糖清除ABTS+自由基能力Fig.6 The ABTS+ free radical scavenging ability of polysaccharides

3 结论

利用超声波辅助提取巨大口蘑多糖，依据单因素试验，采取三因素三水平响应面分析方法探讨其对多糖得率的影响。优化巨大口蘑多糖最佳提取工艺条件为：液料比27∶1(mL/g)、提取时间40 min、提取次数2次，与预测模型结果接近，具有实际应用价值。巨大口蘑多糖抗氧化活性随着其质量浓度的增加而增强,对DPPH、ABTS+自由基的清除活性较强，可以作为潜在的天然抗氧化剂开发。