毕宜慧，张鑫宇，李 杰，孙亦如，王浩哲，付东勇，尹绍武

（南京师范大学海洋科学与工程学院，江苏省特色水产育种与绿色高效养殖技术工程研究中心，南京 210023）

暗纹东方鲀（Takifugufasciatus）是隶属于辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲀形目（Tetraodontiformes）鲀科（Tetraodontidae）东方鲀属的江海洄游性鱼类，主要分布于太平洋西岸的中国近海区域及长江中下游地区、朝鲜半岛和日本，在民间多被称为“河豚”。其肉质鲜嫩，具有极高的营养价值和经济价值，被誉为“鱼中之王”，是长江下游重要的水产养殖品种之一［1－3］。人工养殖的暗纹东方鲀营养丰富，食味极鲜，雄性的精巢更是因为无毒与美味，被民间誉为“西施乳”，带有“西施乳”的雄鱼售价接近雌鱼的两倍［4－6］。此外，野生河鲀含有的河豚毒素（TTX）是一种生物碱，通过阻断内向钠电流引起生物体的中毒反应，非常致命，但低浓度时也可用作药物治疗神经疾病，目前已被开发用于临床使用［7］。TTX产量极低，价格极其昂贵，含量最高处为雌性河鲀卵巢［8］。因暗纹东方鲀雌雄个体各有特点，雄性主供食用，雌性（卵巢）主供药用，故应根据用途不同将雌雄个体分开喂养，同时人工繁育时，需在人工授精前按性别设定剂量催产，受精后雌雄分池护理亲鱼。可见，暗纹东方鲀个体的性别区分在生产实践环节尤为重要。

在鱼类人工繁殖过程中，性别判定是进行性别定向控制、选育及繁殖的重要基础［9］。除了根据鱼类第一性征即精巢与卵巢的区别，也可利用鱼类的第二性征（副性征）进行雌雄判别。仅有部分鱼类的第二性征具有明显的差异，例如稀有鮈鲫（Gobiocyprisrarus）的雄鱼胸、腹鳍较雌鱼更长且鳃盖、胸鳍上有细小的棘状珠星［10］；半滑舌鳎（Cynoglossussemilaevis）等鲽形目鱼类，其雌性生长速度和规格均远远大于雄性［11］；中华鳑鲏（Rhodeussinensis）繁殖期间雄鱼体色艳丽，呈金属蓝色，而雌鱼则色泽黯淡［12］。但有些鱼类如鲟科［13］、鲀科［14］等，其雌雄个体间第二性征并无明显的差异，仅凭肉眼无法鉴别，只能根据第一性征进行判别，此法需剖杀活体，造成样本浪费，且不适用于幼龄鱼和珍稀濒危物种。因此，迫切需要开发其他性别鉴定方法。

分子标记技术已被证明是进行鱼类性别特异性遗传标记以及性别控制的有效工具［15－16］，但是存在标记定位困难、耗时久、成本高等缺点［17－19］。另外，超声波技术在条纹鲈（Morone saxatilis）、欧 洲 大 比 目 鱼（Hippoglossus hippoglossus）和大西洋鳕（Cadusmorhua）等鱼类性别鉴定中也发挥了重要作用［20］，但由于其技术的局限性，在实际生产和野外工作中不能快速简便区分雌雄，实用性有局限。而目前利用大量鱼类样本通过测定其形态和框架指标并筛选出特殊指标来进行性别判定则是一种较为简单实用的方法，比如武兆文等［9］基于统计学方法对509尾杂交黄颡鱼（Pelteobagrusfulvidraco）“黄优1号”中的2龄群体和3龄群体分别进行雌雄判别，准确率分别为87.0%和84.2%；吴波等［21］依据所建立的金钱鱼（Scatophagusargus）雌雄判别方程的判别准确率为85.96%；郭弘艺等［22］建立的雌雄判别方程对153尾银色鳗（Anguilla japonica）的识别准确率达到89.3%。由此可见，此法利用统计学方法，无需复杂仪器和技术手段，相较于分子标记技术和超声波技术具有快速、高效、成本低等优点，是一种行之有效的方法。

暗纹东方鲀雌雄个体外形差异较小，且生长规律相似，不易辨别，实际生产中需要有丰富操作经验的人员通过抚摸轻压已发育成熟个体（3～4龄）的性腺进行区分，导致区分困难，易形成技术垄断，无经验的人员操作时甚至有可能对鱼体内脏造成物理损伤。目前已公开的利用引物扩增鉴定东方鲀幼鱼性别的方法尽管精确度高，但是需要提取鱼体的组织，不可避免地会对鱼类造成物理损伤［23］。而DNA提取，引物扩增和测序过程将会耗费大量时间，不利于即时标记性别，成本也过高。面对不足1龄的个体时，从外观和抚摸都无法判断其雌雄，若通过解剖观察性腺以分辨雌雄的话，会导致个体死亡，失去养殖和利用价值。因此，市场上亟需一种耗时短、方法简单、成本低的东方鲀属鱼类性别鉴定方法。本研究利用暗纹东方鲀的形态指标筛选出特定指标进行性别判定，以期为今后暗纹东方鲀人工养殖及新品种培育过程中雌雄的判别提供参考方法和理论依据，也可为其他鱼类的雌雄鉴定方法研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用鱼均于2018年4月采自江苏省江阴市申港三鲜养殖有限公司，共取实验用鱼300尾，2～3月龄左右，剔除无法辨别雌雄的个体后最终得到296尾暗纹东方鲀的有效计量性状。其体长范围为74.90～124.10 mm，体质量范围为（11.752±8.320）～（56.948±8.320）g。通过解剖观察其性腺特征确定性别，其中雌鱼158尾，雄鱼138尾。

1.2 数据测量

测量全部296尾暗纹东方鲀11项计量性状，包括全长［full length，FL；（118.32±10.21）mm］、体长［body length，BL；（101.44±8.23）mm］、头长［head length，HL；（36.43±3.27）mm］、躯干长［trunk length，TL，（33.07±3.48）mm］、尾 柄 长［caudal peduncle length，CPL；（20.32±2.16）mm］、尾柄高［caudal peduncle height，CPH；（9.00±1.10）mm］、体高［body height，BH；（21.50±2.78）mm］、体宽［body width，BW；（23.76±2.74）mm］、眼径［eye diameter，ED；（5.66±0.44）mm］、眼间距［interorbital distance，ID；（19.19±1.90）mm］、体质量［weight，W；（33.17±8.32）g］。长度测量采用游标卡尺（±0.05 mm）（573～642 mm，±0.05 mm），质量测量采用电子天平（JSC-T29-6，±0.001 g），各指标测量方法见图1。肥满度（condition factor，CF）＝体质量（g）／体长3（cm）×100%，体质量精确至0.01 g，体长精确至0.01 cm。

图1 暗纹东方鲀形态测量示意图Fig.1 Schematic diagram of morphometrics of T.fasciatus

1.3 数据处理

为消除个体差异对数据的影响，将测得数据进行整理及计算各性状间的比值，共得到11项计量性状［全长（FL）、体长（BL）、头长（HL）、躯干长（TL）、尾柄长（CPL）、尾柄高（CPH）、体高（BH）、体宽（BW）、眼径（ED）、眼间距（ID）、体质量（W）］及11项比例性状［肥满度（CF）、全长／体长（FL／BL）、头长／体长（HL／BL）、躯干长／体长（TL／BL）、尾柄长／体长（CPL／BL）、尾柄高／体长（CPH／BL）、尾柄长／尾柄高（CPL／CPH）、体高／体长（BH／BL）、体宽／体长（BW／BL）、眼径／头长（ED／HL）、眼间 距／头 长（ID／HL）］。利 用Excel 2019进行数据的初步统计和处理，利用SPSS 21.0软件进行主成分分析和逐步判别分析等。

2 结果与分析

2.1 暗纹东方鲀主成分分析

为简化暗纹东方鲀的外形特征，明确其雌雄形态特点，对暗纹东方鲀雌、雄个体的11项计量性状和11项比例性状进行主成分分析（表1）。KMO和巴特利特球形先行检验证明，296尾暗纹东方鲀KMO取样适切性量数为0.644＞0.600，巴特利特球形检验显著性P＜0.01，表明各比例性状间存在关联，因子降维分析结果可靠。总方差分析最终获得4个主成分，累计贡献率为72.31%，4个主成分及其包含的性状和负荷量见表1。其中主成分Ⅰ的贡献率为31.47%，包括全长（FL）、体长（BL）、头长（HL）、躯干长（TL）、尾柄长（CPL）、尾柄高（CPH）、体高（BH）、体宽（BW）、眼间距（ID）、体质量（W）10项计量性状，反映了暗纹东方鲀的整体轮廓指标；主成分Ⅱ的贡献率为18.64%，包括体高（BH）、尾柄高／体长（CPH／BL）、尾柄长／尾柄高（CPL／CPH）、体高／体长（BH／BL）、体宽／体长（BW／BL），主要反映了暗纹东方鲀的整体及尾部的浑圆程度；主成分Ⅲ贡献率为11.32%，包括头长／体长（HL／BL）、眼径／头长（ED／HL）、眼间距／头长（ID／HL），主要反映了暗纹东方鲀的头部特征；主成分Ⅳ贡献率为10.89%，包括肥满度（CF）和尾柄长／体长（CPL／BL），主要反映了暗纹东方鲀的尾部特征。

表1 4个主成分贡献率及各个指标负荷量Tab.1 Contribution rate of four principal components and the load capacity of each index

根据主成分分析的结果，对主成分Ⅰ与主成分Ⅱ的雌雄个体主成分的得分做散点图（图2），从图2中可以看出，圆形相较三角形更偏上方聚集，雌鱼相较于雄鱼在主成分Ⅱ的得分上更高一些。

2.2 暗纹东方鲀雌雄判别分析

对所采集的296尾暗纹东方鲀11项计量性状及11项标准化性状进行逐步判别分析，依据各变量对判别模型的贡献大小逐步剔除不相关变量，最终共筛选出5个变量，分别为X1（眼径，mm）、X2（肥满度）、X3（头长／体长）、X4（尾柄高／体长）、X5（体宽／体长）。这5个形态指标反映了暗纹东方鲀雌雄个体在整体轮廓上的差异，根据筛选出的5个变量所建立的典型判别模型方程为：

判别函数的显著性检验显示P＜0.01，表明判别函数达到极显著水平。分别计算出雌雄个体的判别分数值，得到暗纹东方鲀雌雄个体的频布图，表明该模型可以用于区分暗纹东方鲀的性别（图3，图4）。

图3 暗纹东方鲀雌性个体判别分数频布Fig.3 Frequency distribution of discriminant score of female T.fasciatus

图4 暗纹东方鲀雄性个体判别分数频布Fig.4 Frequency distribution of discriminant score of male T.fasciatus

根据所建立的判别方程，对所采集的296尾暗纹东方鲀进行回判，将每尾个体的5个特征参数值带入方程，分别计算F1和F2，如果F1＞F2，则该个体为雌性，反之则为雄性。经验证，该判别方程的综合判别准确率达81.1%，其中雌性判别准确率为84.2%，雄性判别准确率为77.5%（表2）。

表2 暗纹东方鲀性别判别结果Tab.2 Discriminant results of sexual distinction of T.fasciatus

对用于建立判别函数的5个形态指标进行t检验，结果显示，5个形态指标中只有尾柄高／体长和体宽／体长两个标准化性状在暗纹东方鲀雌雄个体间呈现出极显著差异（P＜0.01）（表3），表明雌性个体身体较宽、尾柄较高。

表3 特征性状的t检验及暗纹东方鲀雌雄形态差异Tab.3 t-test of characteristics and morphological differences between female and male T.fasciatus

3 讨论

鱼类在脊椎动物的演化过程中处于承上启下的地位，是分布最广泛、种类最丰富的脊椎动物类群，现存三万多种，超过了其他脊椎动物的总和，同时鱼类的性别鉴定也一直是国内外的研究热点［24］。鱼类雌雄个体间存在生长差异的现象，例如鳜（Sinipercachuatsi）［25－26］、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）［27］和半滑舌鳎（Cynoglossussemilaevis）［28］等，其雌雄个体间生长速度存在明显差异。近年来，为有效区分鱼类性别，多元统计分析方法被广泛应用于水产领域，许多学者将统计学中的主成分分析、聚类分析、判别分析等应用于水产动物雌雄个体形态差异的比较，如岳亮等［14］依据所建立的判别方程对72尾红鳍东方鲀（Takifugurubripes）的雌雄判别准确率为81.9%；谌微等［29］对554尾大黄鱼（Larimichthyscrocea）进行了主成分分析及判别分析等，其结果显示，雌鱼个体间变异较雄鱼更大，其中体厚指标差异最显著；周惠强等［30］对248尾大刺鳅（Mastacembelusarmatus）进行差异显著性分析、主成分分析、R-聚类分析和判别分析后得出，大刺鳅雌性个体相较于雄性个体头部和躯干部较长，眼距较宽，体高较高，其判别方程准确率为69.2%，研究结果为鱼类性别鉴定提供了借鉴。

本研究通过296尾暗纹东方鲀的11项计量性状和11项标准化性状，采用主成分分析、逐步判别分析和t检验的方法，最终筛选出眼径、肥满度、头长／体长、尾柄高／体长、体宽／体长5个相关变量，并建立了暗纹东方鲀雌、雄判别模型。本研究发现，2～3月龄的暗纹东方鲀雌雄个体差异主要集中在尾部特征和长宽比例上，雄性个体较雌性个体尾柄在比例上相对较窄，体型相对窄长。与同为东方鲀属的红鳍东方鲀相比，岳亮等［14］的研究表明，红鳍东方鲀雄性特征为体形较宽、体周长较长，形成此差异的原因可能是两者选取的养殖群体年龄不同。性腺的发育程度能够影响鲀类的腹围和体宽。岳亮等［14］选取2～3年龄的红鳍东方鲀，其雄性个体性成熟较早，雌性个体未性成熟，因此造成雄性特征为体形较宽、体周长较长，与华元渝等［31］的研究结果契合。而本研究选取2～3月龄的暗纹东方鲀幼鱼，其雌雄个体生长速度区分不明显，性腺发育不成熟，体型差异受性腺影响较小，2～3月龄雄鱼反而体型相对较窄，与岳亮等［14］的研究结果相反。因为目前并无对暗纹东方鲀幼鱼的生长特征研究，根据本研究结果推测，雄鱼偏窄的尾柄和体型可能使其更加灵活，扩大其生存优势。运用逐步判别分析所建立的雌雄判别方程，其对暗纹东方鲀雌雄个体综合判别的正确率为81.1%，表明依据所选出的5个外形特征可以用于判别其性别，值得注意的是本方法仍具有一定局限性，所构建的方程对群体要求较高，由于不同群体生活环境等的差异，即使年龄相同也可能存在较大差异，因此在应用此法时最好根据所养殖的群体重新构建判别方程，以免造成较大误差，在岳亮等［14］、吴波等［21］的研究中也表明了这一点。本研究从形态学方面，利用多元统计分析方法对暗纹东方鲀雌雄进行鉴定，耗时短、操作简单、基本无需成本，在实际生产中降低了对技术人员的依赖性，是一种简便可行的暗纹东方鲀性别鉴定方法，也为其他鱼类性别鉴定提供了借鉴。