孙雷涛，杜德勇，李 勐，李泽福，张文生

（滨州医学院附属医院神经外科，山东滨州 256603）

早期准确评估脑微血管内皮细胞(brain micro⁃vascular endothelial cells,BMECs)的损伤程度对研究蛛网膜下腔出血后早期脑损伤机制至关重要[1]。外泌体是细胞外膜囊泡，大小为40~100 nm，可由多种细胞类型分泌，如T淋巴细胞、神经元和BMECs[2-3]。外泌体中包含多种遗传相关分子及蛋白，影响细胞增殖、凋亡和功能。外泌体同样存在于脑脊液(cerebro⁃spinal fluid,CSF)循环中。由于CSF布满中枢神经系统并与受损组织广泛接触，被认为是研究与中枢神经系统损伤相关的miRNAs的重要途径[4]。

1 材料与方法

1.1 细胞培养人BMECs购自美国Kirkland公司。BMECs培养于DMEM培养基，并置于37℃50 mL/L CO2培养箱中。

1.2 建立BMECs损伤模型根据FINDLAY等[5]的方法制作人工血性脑脊液(BCSF)。在无菌条件下将正常血液与人工脑脊液按1∶1混合。于37℃水浴箱孵育7 d后取样离心(10 000 g，20 min)。收集BMECs并储存于4℃。将BMECs加入培养板或培养瓶培养24 h后加入无血清培养基同步，随机分为正常对照组和BCSF刺激组(BCSF 1、3、7、12 d组)。正常对照组加入正常脑脊液，BCSF各刺激组加入BCSF，共培养3 d后将这两组细胞分别接种于96孔板（细胞密度为1×104/孔）。将空孔设置为空白对照；仅加相应脑脊液而无细胞孔为阴性对照。均设3个复孔。

1.3 MTT法测定BCSF对BMECs增殖的影响各组完成相应干预培养后，加入5 mg/mL MTT(20 μL/孔)。于37℃孵育4 h，加150 μL DMSO孵育15 min。于490 nm酶标仪(Bio-Rad Laboratories,Inc)测定吸光度后，绘制细胞存活曲线。

1.4 细胞周期分析将密度为5×104/孔的BMECs于2 mL DMEM接种于6孔板，24 h达到70%融合，在无血清培养基中同步24 h，分为正常对照组和BCSF刺激组。孵育48 h，用细胞周期试剂盒(KeyGen Biotech Co,Ltd)检测各组1×104个细胞的DNA含量。用ModFit LT 3.2软件分析细胞周期分布，用BD FACS Calibur(BD Bioscience USA)对样品进行分析。……