钱薇，褚明亮，刘杰民

（1.贵州中医药大学基础医学院，贵州 贵阳550025；2.贵州中医药大学第一附属医院检验科，贵州 贵阳550001；3.贵州省人民医院消化内镜科室，贵州 贵阳550002）

肺癌即原发性支气管肺癌，主要病变于支气管黏膜上皮及肺泡，是我国及世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。现阶段肺癌治疗多以手术切除和放化疗为主，存在预后较差及复发可能性大等一系列问题。我国最早于《晋书》中有对癌症手术治疗的记载，历代医家认为气滞血瘀、痰结湿聚、热毒聚集而至肿块结节于肺是肺癌发生的病因。研究表明山慈菇可以化痰之功效解肺之肿块[1]。

山慈菇为兰科植物杜鹃兰[Cremastra appendiculata(D.Don)Makino]、独蒜兰[Pleione bulbocodioides(Franch.)Rolfe]或云南独蒜兰（Pleione yunnanensis Rolfe）的干燥假鳞茎。山慈菇性凉，味微辛、甘，具有清热解毒、化痰软坚散结等功效。现代临床用于内、外、妇、儿、五官以及皮肤等疾病的治疗，尤其在治疗各类肿瘤方面效果显著[2]。周仲瑛[3]指出，山慈菇主要作用为化痰散结，中医认为肺癌是由于痰浊较盛、结聚成块于肺而成，故用山慈菇可化其痰解结节。山慈菇化学成分主要有多糖、二氢菲类、联苄类、甾类、黄酮类以及其他类化合物[4]。药理学研究表明山慈菇具有抗肿瘤、降压、抗菌、激活酪氨酸酶和毒覃碱M3受体阻断等活性[5]。山慈菇通过细胞毒作用、抑制癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡和抑制肿瘤新生血管生成等方面抑制癌细胞生长繁殖[6]。目前山慈菇的抗癌作用研究较为局限，其具体的药效物质基础及作用机制鲜有报道，因此在网络药理学和分子对接基础上分析山慈菇的抗癌作用机制，可为其临床应用研究提供部分科学依据。

1 材料与方法

1.1 软件与数据库

UniProt蛋白数据库（https://www.uniprot.org/），中药系统药理学分析平台（TCMSP,https://tcmspw.com/tcmsp.php），DrugBank数据库（http://www.drugbank.ca/），Cytoscape 3.7.1软件（https://cytoscape.org/），V2.1（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）GeneCard数据库（https://www.genecards.org/），Stringdb数据库（https://stringdb.org/）、Metascape数据库（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）、PDB数据库（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do ）、PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）。

1.2 山慈菇活性成分的筛选

通过TCMSP数据库收集山慈菇的化学成分，时间截至2020年11月，并依据TCMSP数据库的口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30%和类药性指数（drug like index,DL）≥0.18为筛选条件[7,8]，获得山慈菇的有效活性化合物，并利用Uniport数据库进行基因标准化核对，把相应靶点蛋白名称转化为对应的基因名称。

1.3 山慈菇活性成分-靶点网络的构建

通过TCMSP数据库收集“1.2”项下山慈菇中的活性成分的对应靶点，利用Cytoscape3.7.1软件构建“活性成分-靶点”网络图。

1.4 肺癌靶点信息的筛选

在Genecard数据库中输入关键词“lung cancer”，由于获得相关靶点过多且有部分靶点与肺癌关联分数所以通过Excel筛选关联分数列中位数的方式，筛选4次后获得最适中位数12.43，之后通过Relevance score≥12.775对所得靶点进行筛选，得到GeneCards数据库肺癌相关靶点信息；在Drugbank数据库中输入关键词“lung cancer”进行搜索，得到Drugbank数据库肺癌相关靶点信息。将以上两个数据库筛选后获得的靶点信息进行合并去重。

1.5 山慈菇活性成分靶点和肺癌疾病靶点的可视化网络数据图

运用Unitprot数据库对“1.3”项和“1.4”项所得蛋白质靶点数据进行标准化，采用VENNY 2.1对山慈菇活性成分作用靶点与肺癌疾病靶点进行交集，然后运用Cytoscape 3.7.1软件构建山慈菇活性成分靶点和肺癌疾病靶点的可视化网络数据图。

1.6 山慈菇治疗肺癌疾病靶点蛋白互作网络构建

在STRING11.0数据库中上传“1.5”项山慈菇活性成分作用靶点与肺癌疾病靶点的交集靶点，获得靶点预测蛋白与蛋白之间相互作用的关系。在设置中选取蛋白间最低互作得分>0.700作为蛋白之间相互作用的信度依据，并隐藏网络联结外的节点，最终得到了蛋白相互作用的网络图。

1.7 GO和KEGG通路富集分析

使用Metascape数据库对“1.5”项中得到的抗癌靶点进行GO和KEGG生物通道富集分析，筛选出癌症相关通路；并利用Cytoscope 3.7.1软件，构建“靶点-KEGG通路”网络。

1.8 分子对接验证

在PDB数据库中检索并下载互作靶点蛋白3D图，并在PubChem数据库中下载3个主要化合物的2D结构，利用Chem3D进行优化。利用PyMOL 2.4.0软件对化合物进行除水、去除原配体，最后运用Auto-Dock的可视化软件进行分子对接。

2 结果与分析

2.1 山慈菇的活性成分的筛选

传统中药多为口服，在人体中的吸收（Absorption）、分布（Distribution）、代谢（Metabolism）和外排（Excretion），即ADME，是传统口服中药必然经历的人体代谢过程。OB和DL是ADME系统的2个主要性能指标，其中OB值≥30，DL≥0.18作为中草药类药化合物的筛选标准，筛选出了3个符合条件的山慈菇的活性化合物。查阅相关文献获得3个经实验证实的活性化合物，分别为乙酸乙酯（Ethyl acetate）[9]、秋水仙碱（Colchicine）[10]和正丁醇（N-butanol）[11]，见表1。

2.2 山慈菇活性成分-靶点网络的构建

通过TCMSP数据库以及相关文献收集山慈菇中的6个活性成分的对应靶点，共获得105个药物靶点蛋白。利用Uniport数据库检索105个靶点蛋白的对应基因名并进行标准化检索，其中9个蛋白Heat shock protein HSP 90、mRNA of PKA Catalytic Subunit C-alpha、5-hydroxytryptamine 2A receptor、Ig gamma-1 chain C region、Aldose reductase、Thrombin和Cell division protein kinase 2、Alcohol dehydrogenase 1B、Cytochrome P450-cam、2-hydroxy-6-oxo-7-methylocta-2,4-dienoate hydrolase未找到对应基因名称，7个蛋白Cytochrome P450-cam、Cytochrome P450-cam、Ferrichrome-iron receptor、Monomeric sarcosine oxidase、Bacillolysin、Haloalkane dehalogenase、Haloalkane dehalogenase的对应基因为非人源基因，除去重复基因，最后共获得68个药物靶点蛋白对应基因，见图1。

图1 山慈菇活性成分-靶点图Fig.1 The active ingredient-target figure of Cremastra appendiculata

2.3 山慈菇药物靶点-肺癌靶点网络构建

在GeneCards数据库中共获得23 108个与肺癌相关的基因和靶点信息，经Relevance score≥12.775筛选后获得2 115个与肺癌相关的基因和靶点信息。在Drugbank数据库中收集了148个与肺癌相关的基因和靶点信息。将两个数据库的基因合并后除去35个重复基因，共获得1020个与肺癌相关的基因和靶点信息，见图2。运用Unitprot数据库对68个山慈菇药物靶点蛋白和1 020个肺癌相关所得蛋白靶点数据进行标准化，采用在线韦恩获得山慈菇药物靶点与肺癌疾病靶点共有靶点32个，见图2和图3。

图2 山慈菇的药物-癌症靶点韦恩图Fig.2 Cancer-drug targets Venn diagram of Cremastra appendiculata

2.4 山慈菇活性成分靶点和肺癌靶点网络数据图

利用Cytoscope 3.7.1软件构建山慈菇活性成分靶点和肺癌靶点网络数据图，见图3。显示共39个节点（5个化合物节点，1个疾病节点，1个药物节点，32个靶点节点）和80条边。其中红色节点代表山慈菇，黄色节点代表肺癌疾病，紫色节点代表有效活性成分节点，绿色节点代表目标靶点节点，黑色的线条代表有效活性成分与目标靶点之间相互作用关系。网络图中的节点的度值表现其与其他节点的相连性，节点的度值与节点的关键性成正比。其中-谷甾醇（beta-sitosterol）的度值（degree）最高，为34，见图3。由图观察可知正丁醇（N-butanol）的相关药物靶点与肺癌靶点无交集靶点。

图3 山慈菇活性成分靶点和癌症靶点网络图Fig.3 The active ingredients-targets network map and cancer-targets network data graph of Cremastra appendiculata

2.3 山慈菇作用肺癌靶点蛋白互作网络构建

在STRING数据库中上传32个肺癌-药物共同靶点，并设置蛋白参数评分值＞0.400，由此获取相应蛋白互相作用信息。将网络信息TSV数据格式导入Cytoscope 3.7.1软件构建各蛋白互相作用的PPI网络后，进行拓扑分析，其中CASP3、JUN、ESR1、PTGS2、MAPK14、PIK3CA和CASP8等基因的节点度值为12，明显高于其他靶点，见图4。

图4 山慈菇治疗癌症疾病靶点蛋白互作PPI图Fig.4 The treatment of cancer diseases targeted protein interactions PPI figure of Cremastra appendiculata

2.4 互作靶点基因的KEGG通路和GO富集化分析

使用Metascape数据库进行富集化分析，将32个肺癌-药物共同靶点进行KEGG通路分析，共获得15条信号通路，具体见表2和图5。使用Cytoscope 3.7.1软件，连接各基因信号通路，构建出“成分-靶点-通路”网络图见图6。从网络图中可以发现32个靶点以及15条通路之间有密切的相互关联作用。其中的癌症通路（Pathways in cancer）和雌激素信号通路（Hepatitis B）与靶点的相互关联最多，分别为16个和11个（图6），且只有4个活性成分存在靶点通路，分别为-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（Stigmasterol）、2-甲氧基-9,10-二 氢 菲-4,5-二 醇（2-methoxy-9,10-dihydrophenanthrene-4,5-diol）和秋水仙碱（Colchicine）。

图5 KEGG通路富集化分析气泡图Fig.5 The enrichment pathway analysis diagram

图6 “成分-靶点-通路”网络图Fig.6 The“components-targets-pathways”network diagram

表2 山慈菇治疗靶点相关通路信息Table 2 Therapeutic targets related pathways of Cremastra appendiculata

在Metascape数据库中将32个肺癌-药物共同靶点进行靶点GO富集化分析，互作靶点与19个分子功能（Molecular Functions）相关，筛选其中count值≥10的分子功能（count值越大代表靶点与某个生物过程的相关性越大）；与20个生物过程（Biological Processes）相关，筛选其中count值≥15的生物过程；与9个细胞组分（Cellular Components）相关（图7）。其中分子功能富集在与神经递质受体活性（neurotransmitter receptor activity）、G蛋白偶联的胺受体活性（G protein-coupled amine receptor activity）、乙酰胆碱受体活性（acetylcholine receptor activity）、蛋白质结构域特异性结合（protein domain specific binding）、转录因子结合（transcription factor binding）、内肽酶活性（endopeptidase activity）、蛋白质均二聚活性（protein homodimerization activity）、金属离子跨膜转运蛋白活性（metal ion transmembrane transporter activity）、蛋白激酶结合（protein kinase binding）和磷酸转移酶活性（phosphotransferase activity）上等；生物过程主要富集在血液循环（blood circulation）、化学突触传递（chemical synaptic transmission）、细胞对有机环状化合物的反应（cellular response to organic cyclic compound）、对有毒物质的反应（response to toxic substance）、神经递质水平的调节（regulation of neurotransmitter levels）、细胞对氮化合物的反应（cellular response to nitrogen compound）、有节奏的过程（rhythmic process）、有机羟基化合物转运（organic hydroxy compound transport）、发育增长的调节（regulation of developmental growth）、MAPK级联反应的正调控（positive regulation of MAPK cascade）及蛋白质定位建立的调控（regulation of establishment of protein localization）上等；细胞组分主要富集在突触后膜（postsynaptic membrane）、膜筏（membrane raft）、突触前膜的组成部分（integral component of presynaptic membrane）、细胞器外膜（organelle outer membrane）、多巴胺能突触（dopaminergic synapse）、血液微粒（blood microparticle）、核包膜（nuclear envelope）、谷氨酸能突触（glutamatergic synapse）和三级颗粒（tertiary granule）上。

图7 GO功能富集分析图Fig.7 The GO function enrichment analysis chart

2.5 分子对接

将-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（Stigmasterol）、2-甲氧基-9,10-二氢菲-4,5-二醇（2-methoxy-9,10-dihydrophenanthrene-4,5-diol）和秋水仙碱（Colchicine）4个药物活性成分与CASP3、JUN、ESR1、PTGS2、MAPK14、PIK3CA及CASP8等交集靶点逐一进行对接，配体与受体可自发结合的结合能指标均小于0，两者的结合能越小，其结合构象越稳定。当结合能≤﹣17.79 kJ/mol时，说明有一定结合活性；当结合能≤﹣20.93 kJ/mol时，说明有较好结合活性；当结合能≤﹣29.30 kJ/mol时，说明有强的结合活性[12]。本研究运用PyMOL 2.4.0软件和AutoDock的可视化软件进行对接（表3），然后选取结合能＜﹣33.93 kJ/mol作为筛选条件并将其对接结果绘制为3D示意图（图8）。除结合能外，分子对接的氢键也是分子对接的柔性程度的重要指标，如图8所示，图8 B与图8 C中均有氢键（黄色虚线）。综上分析豆甾醇和2-甲氧基-9,10-二氢菲-4,5-二醇可能为山慈菇治疗肺癌的关键活性成分。

图8 山慈菇活性成分与靶蛋白对接三维图（结合能≤-33.49 kJ/mol）Fig.8 The three-dimensional diagram of the docking between the active ingredients of Cremastra appendiculata and the target proteins(binding energy≤-33.49 kJ/mol)

表3 山慈菇活性成分与靶点结合能Table 3 The binding energy of active ingredients of Cremastra appendiculata to the target

3 讨论

随着我国医学事业的不断进步以及互联网行业的崛起，药物信息学发展迅速，网络药理学作为一个新型学科把药物与疾病相结合探究疾病、药物与靶点之间的相互作用，从而揭示了中药中多成分-多靶点的作用关系[7,8]。中药具有多成分、多靶点的特点，利用网络药理学方法探究中药的有效活性成分及其与各疾病靶点的相互作用，可为下一步的研究提供一定的参考[7,8,13]。

研究通过TCMSP数据库挖掘，筛选得到山慈菇的4个有效活性成分，包括-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（Stigmasterol）、2-甲氧基-9,10-二氢菲-4,5-二醇（2-methoxy-9,10-dihydrophenanthrene-4,5-diol）和秋水仙碱（Colchicine）。其中-谷甾醇（beta-sitosterol）的度值（degree）最高，为34（图3），说明-谷甾醇与34个靶点蛋白相互作用，该化合物可能为山慈菇治疗癌症疾病的重要化合物。研究表明，-谷甾醇具有多种药理作用，如降血脂、抗炎及抗癌作用[14-16]。-谷甾醇在对抗肺癌、乳腺癌、前列腺癌和结肠癌等方面具有重要作用[17]。-谷甾醇可抑制癌细胞系鞘磷脂周期的激活，阻滞细胞周期以及刺激凋亡细胞死亡[15]，影响细胞周期从而抑制癌症细胞的过度增殖，抑制癌症细胞的增生和分化，诱发癌症细胞凋亡[18,19]。-谷甾醇可抑制瘤体中血管内皮细胞生长因子（VEGF）的异常升高，抑制新生血管的异常生成，抑制肿瘤的生长[20]，且分子对接结果表明，-谷甾醇对MAPK14和PIK3CA均有较好的结合活性，但其在结合过程中无氢键连接，实际结合情况可能存在较大差异。而2-甲氧基-9,10-二氢菲-4,5-二醇和豆甾醇与CASP3、JUN、PTGS2、MAPK14和PIK3CA均有结合活性且结合过程中存在多个氢键连接。因豆甾醇为植物基础化合物，在大部分植物中均含有，所以其不具有独特性。综上，可猜测2-甲氧基-9,10-二氢菲-4,5-二醇为山慈菇治疗肺癌的关键化合物，由于现阶段对此化合物研究较少，所以2-甲氧基-9,10-二氢菲-4,5-二醇是否能发挥其抗癌效用还需进一步实验证实。

PPI蛋白互作网络表明，CASP3、JUN、ESR1、PTGS2、MAPK14、PIK3CA和CASP8等基因的节点度值＞12，明显高于其他靶点见图5，说明上述靶点可能是山慈菇治疗肺癌的核心潜在靶点。CASP3是重要的凋亡信号分子，其在肺癌组织中有显著性差异的升高表达[21]。JUN参与多种信号通路，调控肺癌、胃癌等肿瘤细胞的增殖、凋亡[22,23]。ESR1基因是雌激素受体1基因，其单核苷酸多态性与多种肿瘤，特别是乳腺癌的内分泌治疗效果密切相关[18]。PTGS2是前列腺素内环氧化物合成酶2，此基因为诱导性即刻反应基因，在人体正常生理状态下不表达，但在炎症和肿瘤因子的刺激下表达上调，其用作调控肿瘤细胞的重要指标[24]。MAPK14是丝裂原活化蛋白激酶14，为MAPK3个主要亚家族中的一员，是VEGF通路的重要靶点，其激活可促进癌细胞的凋亡或抑制癌细胞的增殖，被称为肿瘤抑制因子[25,26]；PIK3CA是常见的原癌细胞之一，主要作用机制为活化PI3Ks以此促进肿瘤细胞的活化、细胞间的黏附以及增殖[27]；CASP8是半胱天冬酶8基因，CASP8为CASP家族中的一个重要亚基，CASP基因在生物体中的作用是维持基因相互作用和信号的调控，在诱导细胞内外途径凋亡上发挥着重要作用[28]。

对交集靶点进行GO分析和KEGG分析进一步探究山慈菇对肺癌的发生机制。结果表明，山慈菇通过对血液循环、化学突触传递、对有毒物质的反应、神经递质水平的调节、发育增长的调节和MAPK级联反应的正调控等生物过程及在G蛋白偶联的胺受体活性、乙酰胆碱受体活性、蛋白质结构域特异性结合、转录因子结合和蛋白激酶结合等分子反应上，进而调控癌症通路（Pathways in cancer）和雌激素信号通路（Estrogen signaling pathway）等发挥山慈菇对肺癌细胞的抑制作用。雌激素信号通路主要通过与ER受体的结合启动膜ER信号通路，从而激活ER和ER对癌细胞的抑制作用，同时也可激活PI3K或MAPK信号通路从而达到对肺癌细胞的抑制性作用[29]，且CASP3、JUN、ESR1、PTGS2、MAPK14、PIK3CA、CASP8等关键靶点均富集在此通路上，由此可知山慈菇和肺癌疾病及雌激素的调节均相关，也许这就是山慈菇对肺癌有较好治疗效果的分子机理[30-32]。

4 结论

该研究在网络药理学和分子对接的方法多成分、多靶点、多通路地对山慈菇进行了复杂的网络关系探究，研究结果与相关文献报道基本吻合，初步分析了山慈菇的作用机制和药理作用，为进一步的探究提供了良好的基础，指明了山慈菇中2-甲氧基-9,10-二氢菲-4,5-二醇等潜在有效成分，作用于CASP3、JUN、ESR1、PTGS2、MAPK14、PIK3CA和CASP8等多个靶点，并通过癌症通路、雌激素通路等参与外在细胞凋亡、有效蛋白激活及氧化应激反应等发挥山慈菇对肺癌的治疗作用。但该研究还存在一定局限性，由于中药多口服，所以药物服用后在不同人体中实际发挥的药效作用与网络分析中筛选的活性化学成分以及作用效果不尽相同，因此下一步还需要具体实验对其研究结果进一步证实。