黄敏 许超 黄华云 黄华栋 李冬辉

视神经脊髓炎（neuromyelitis optica，NMO）是一种免疫介导的以视神经与脊髓同时或相继受累为主的中枢神经系统炎性脱髓鞘病变[1]。研究表明，NMO患者体内会伴随出现 αβ-晶状体蛋白（crystallin-αβ，Cryab）表达异常[2]。Cryab具有神经保护作用，当视神经出现病变，外周血中Cryab水平会发生明显改变[3]。同时NMO患者常合并广泛的脑部损害与异常，临床常使用MRI检测对其进行诊断评价[4]。虽然NMO患者在发病初期颅脑MRI图像与正常人群没有明显差异，但随着疾病发展可在颅脑部特定区域产生诸如“云雾样”“铅笔芯样”等特定样强化病灶，成为临床鉴别和诊断NMO的重要依据[5]。而对于颅脑MRI的判定需要在扫描结束后由专业人员完成，以检测颅脑病变情况。本研究通过分析NMO患者的外周血Cryab变化和MRI诊断信息，探讨两者对NMO的诊断价值。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2019年1月至2020年2月长兴县人民医院收治的NMO患者53例作为NMO组，所有患者均参照Wingerchuk等[6]发表的NMO诊断标准予以确诊。其中男 18 例，女 35 例；年龄 18～60（45.14±12.71）岁；病程2 d～5年，平均（2.7±0.6）年。选取同期在本院门诊进行健康体检的健康志愿者50例作为对照组，其中男20例，女 30 例；年龄 19～58（44.22±15.42）岁。两组研究对象性别和年龄比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究经医院医学伦理委员会审批通过（IV-H3130000-011A），所有患者均知情同意。

1.2 主要试剂和仪器 总蛋白抽提试剂盒购自美国Hyclone公司；Cryab一抗购自美国BioLegend公司；羊抗兔二抗购自美国CST公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自美国Thermo公司；高效显影胶片、显影液、定影液购自德国柯达公司；ECL-Plus试剂及聚乙烯二氟（PVDF）膜购自美国Millipore公司；倒置显微镜购自德国Olympus生命科学公司；-80℃冰箱购自美国Thermo公司；高速离心机购自德国Eppendorf公司；CO2培养箱购自日本SANYO公司。

1.3 方法

1.3.1 外周血Cryab表达水平检测 采用Western blot法。主要步骤如下：空腹状态下，收集研究对象外周血作为样本，采用总蛋白抽提试剂盒提取全血的蛋白质，并采用BCA定量法测定蛋白浓度。蛋白定量后，配置为1 μg/μl的蛋白溶液。配置浓缩胶、分离胶和缓冲液，以10 μl/孔的用量将蛋白溶液上样于浓缩胶，运用湿转法，90 V恒压电泳80 min，电泳后，不同分子量的蛋白被分开。丽春红染液确认分离效率，并将分离后的蛋白印迹电转印至0.22 μm孔径的PVDF膜，转印条件为80 V×60 min。电转印结束，5%的脱脂牛奶封闭非特异性抗体，加入一抗（3%的脱脂牛奶配置，浓度1∶2 000），4℃孵育过夜，次日，TBST 洗膜后加入二抗（浓度 1∶2 500），室温孵育90 min。抗体孵育后采用ECL发光试剂盒显色，初步观察目的条带，目的条带清晰者转入暗室进行胶片显影，所得胶片扫描为灰度图，并用图像分析软件Image J 6.0对图像进行灰度分析。外周血Cryab的表达检测委托杭州欧蒙未一医学检验实验室完成。

1.3.2 MRI检查方法 采用1.5T MR扫描仪（荷兰飞利浦公司）对患者颅脑进行MRI扫描分析。8通道头颅正交线圈，横断面双回波T2WI扫描。参数设置：TR：3 000 ms，TE：25/29 ms，ETL：8，NEX：2，矩阵：256×256。横断面、矢状位、冠状位液体衰减反转恢复序列（FLAIR）T2WI扫描，参数设置：TR：9 600/1 718 ms，TE：100 ms，TI：2 400 ms，NEX：1，矩阵：256×192。横断面 FLAIR T1WI扫描，参数设置：TR：2 000 ms，TE：6.9 ms。将颅脑 MRI影像出现特定样强化病灶判定为NMO阳性，然后计算MRI检查对NMO诊断的灵敏度和特异度。

2 结果

2.1 外周血Cryab表达对NMO的诊断效能 NMO组患者外周血Cryab表达水平为0.825±0.251，高于对照组的 0.305±0.077，差异有统计学意义（P＜0.05）。典型样品Western blot显影见图1。外周血Cryab表达对NMO的诊断价值相对较高，AUC=0.840，P＜0.01，最佳截点值为0.594，灵敏度为0.774，特异度为0.860，见图2。

图1 两组研究对象外周血αβ-晶状体蛋白（Cryab）表达的电泳图[对照组1和对照组2为对照组的两个典型样品，视神经脊髓炎（NMO）组1和NMO组2为NMO组的两个典型样品]

图2 外周血αβ-晶状体蛋白（Cryab）表达诊断视神经脊髓炎（NMO）的ROC曲线

2.2 MRI检测情况分析 MRI检查显示，NMO阳性36例，阴性67例；MRI检查对NMO诊断的灵敏度、特异度分别为 0.679（36/53）、1.000（50/50），见表 1。图 3 为 MRI检查中典型的阳性结果，相比于正常的颅脑MRI，阳性结果会在颅脑特定区域出现“云雾样”“铅笔芯样”强化病灶。

图3 MRI检查中典型的阳性结果图（a：“云雾样”强化病灶；b：“铅笔芯样”强化病灶）

表1 MRI检测情况分析（例）

2.3 外周血Cryab联合MRI检测对NMO诊断的一致性评价 外周血Cryab联合MRI检查对NMO诊断的灵敏度、特异度分别为 0.755（40/53）、1.000（50/50），见表2。相比于单独检测，两者联合检测的灵敏度与特异度均得到较大提高，且与临床确诊结果的一致性处于良好水平（Kappa=0.749）。

表2 外周血Cryab联合MRI检测情况分析（例）

3 讨论

NMO又被称为Devic综合征，是由一组体液免疫参与的抗原-抗体介导的严重中枢神经系统特发性炎性脱髓鞘性疾病，发病过程中患者常常伴随视神经炎和脊髓炎反复发作，由于临床研究对NMO的认识不足，缺乏良好诊断的依据，导致患者临床诊断与治疗效果较差[7-8]。研究表明，早期有效诊断可以明显降低NMO复发率和致残率，对于治疗NMO具有极大的意义[9]。

NMO发病过程中主要损伤中枢神经系统的星形胶质细胞[10]，对星形胶质细胞起保护作用的Cryab就成为一个研究热点。Cryab是晶状体中的主要蛋白成分之一，属于小分子热休克蛋白家族[11]，与多种眼科疾病如白内障[12]、NMO[13]等的发生与发展密切相关。研究Cryab在不同疾病中的表达状态能为疾病预防和治疗提供一定的理论依据[14]，相关研究显示，视神经病变患者Cryab呈现出异常升高的状态[15-16]，与本研究结果基本一致。此外，本研究结果显示Cryab表达诊断NMO的灵敏度和特异度分别为0.774和0.860，进一步证实了其诊断学价值。由于NMO的发病过程中会伴随感觉减退甚至消失、四肢乏力、行走困难等中枢神性系统病变的特征，颅脑局部病变也是NMO的一个重要发病征象，既往研究指出，NMO患者的神经病变主要集中在大脑皮质下及深部脑白质、脊髓束、胼胝体等与视神经相关的神经区域，病变形态大多数也呈现为斑片样、点状或类圆状[17-18]。本研究结果也显示NMO患者在MRI扫描中出现颅内、视神经内病灶的部分强化，因此需要对NMO患者进行MRI检查辅助诊断[19]。本研究显示MRI检查对NMO诊断的灵敏度、特异度分别为0.679和1.000；根据特异度的表现，证实对于NMO的诊断，MRI检查必不可少，能够与其他疾病较好地区分开；但同时根据MRI检查在灵敏度上的表现，说明对于NMO的诊断，单一的MRI检查尚不足以满足临床诊断所需。因此本研究集两者之优势，考察了Cryab表达联合MRI检测对NMO的诊断效能，发现两者联合检测的灵敏度和特异度分别为0.775和1.000。

综上所述，外周血Cryab联合MRI检测能够更加有效诊断NMO，对于早期有效诊断NMO具有极其重要的价值。同时两者联合检测还能够及时反映疾病发展情况，利于为疾病的治疗提供更为科学的诊断依据，提升NMO患者的临床诊治水平。