单家明，孟 岩，李焐仪，熊 豪，杨武亮

（江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室，江西，南昌 330004）

大黄是蓼科植物掌叶大黄（Rheum palmatumL.）、唐古特大黄（Rheum tanguticumMaxim. ex Balf.）或药用大黄（Rheum officinaleBaill.）的干燥根和根茎，具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄的功效[1]，其中具有泻下作用的是蒽醌类物质[2～4]。大黄主产于甘肃、青海、四川、重庆等地。作为多产区药材，由于地理环境和气候因素的影响，不同产地的大黄在化学成分的组成和含量上必定存在一些差异[5]。高效液相色谱（HPLC）从化学成分的角度对中药进行分析，是目前中药分析鉴别最常用的方法之一[6]，但该方法的样品制备过程往往较为复杂。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）具有操作简单、样品需求小和分析迅速等特点[7]，同时，红外光谱从整体性的角度对中药材进行分析，能够对中药的原始信息进行最真实的反映，对于同一中药，其化学成分的差异能够通过红外光谱中吸收峰的数目、位置、强度及形态表现出来[8]。本研究分别采用上述两种方法对37 批大黄药材进行分析，并对其品种和产地进行了区分。

1 仪器与试药

1.1 仪器与软件

仪器：万分之一天平（型号：Sartorius BT 224 S，北京赛多利斯仪器系统有限公司）；十万分之一电子天平（Sartorius BT 25 S，北京赛多利斯仪器系统有限公司）；Spectrum Two 傅里叶变换红外光谱仪（Perkin Elemer 公司）； Agilent 1260 高效液相色谱仪（包括四元泵、在线脱气机、自动进样器、DAD检测器和色谱工作站）。

软件：OMNIC 8.2 红外分析软件、中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012 软件。

1.2 药材与试剂

1.2.1 药材

掌叶大黄标准药材（批号：121249-201304）、药用大黄标准药材（批号：120984-201202）；芦荟大黄素（批号：110722-201815）、大黄酸（批号：110721-201818）、大黄素（批号：111857-201703）、大黄酚（110796-201621）、大黄素甲醚（110758-201616），均购自中国食品药品检定研究院。芦荟大黄素-8-O-β-葡萄糖苷（批号：PS1497)、芦荟大黄素-3-（羟甲基）-O-β-D-葡萄糖苷（批号：PS1495)、大黄酸-8-O-葡萄糖苷（批号：PS1697)、大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷（批号：PS1506)、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷（批号：PS1507)、大黄素甲醚-8-O-β-D 葡萄糖苷（批号：PS1508)、大黄素甲醚-1-O-β-D 葡萄糖苷（批号：PS1524)、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷（批号：PS1521)，均购于成都普思生物科技股份有限公司，含量HPLC 归一化均为98%。

所有大黄均由江西樟树药都制药有限公司提供，经江西中医药大学赖学文教授鉴定。大黄品种及产地详见表1。

表1 样品信息Table 1 Information of sample

1.2.2 试剂

溴化钾（光谱纯，上海麦克林生化科技有限公司）；甲醇（AR 级）；甲醇（HPLC 级）。

2 方法

2.1 供试品与混合对照品的制备

2.1.1 红外供试品的制备

取大黄粉碎，过五号筛，置于烘箱中60℃干燥2 h，KBr 粉末置于烘箱中120℃干燥4 h，备用。取粉碎后的大黄粉末约2 mg 与KBr 粉末按1:100混合，在研钵中研磨，在10 t 的压力下压成薄片。

2.1.2 HPLC 供试品的制备

取大黄粉末（过四号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL 并称重，水浴回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45 μm 膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 大黄混合对照品的制备

精密称定各对照品，分别置容量瓶中配制成母液；用移液管精密吸取上述各对照品母液适量，置于25 mL 容量瓶，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得含芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷25.93 μg/mL、大黄酸-8-O-葡萄糖苷6.10 μg/mL、大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷13.25 μg/mL、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷33.26 μg/mL、芦荟大黄素-3-（羟甲基）-O-β-D-葡萄糖苷16.24 μg/mL、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷7.97 μg/mL、大黄素甲醚-1-O-β-D 葡萄糖苷10.72 μg/mL、大黄素甲醚-8-O-β-D 葡萄糖苷7.13 μg/mL、芦荟大黄素7.44 μg/mL、大黄酸6.06 μg/mL、大黄素7.55 μg/mL、大黄酚6.10 μg/mL 和大黄素甲醚4.87 μg/mL 的混合对照品溶液，备用。

2.2 红外光谱条件

红外光谱扫描范围4000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，累计扫描16 次，扫描时去除水和CO2的干扰。每个样品重复扫描3 次，用OMNIC 8.2 软件得到每个样品的平均光谱，对平均光谱进行基线校正、13 点平滑、归一化处理，对处理后的光谱进行求导，得到二阶导数光谱。

2.3 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18柱(15 0 mn×4.6 mm,5 μm)；流动相：A 为磷酸水（pH=3），B 为甲醇，梯度洗脱，0 min，B:20%，0～60 min，B:20%→90%，60-70 min，B：90%→100%；流速：1 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：25℃；进样量：5 μL。

3 结果

采用Spectrum Two 傅里叶变换红外光谱仪和Agilent 1260 高效液相色谱仪测得大黄药材红外原始光谱和HPLC 指纹图谱，用OMNIC 8.2 和中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012 软件处理，得到谱图见图1、图2。

图1 37 批大黄药材原始红外光谱图Fig.1 Original IR spectra of 37 batches of Rhubarb

图2 37 批大黄药材HPLC 指纹图谱Fig.2 HPLC fingerprint of 37 batches of Rhubarb

3.1 聚类分析

聚类分析又称集群分析，现如今被广泛应用于中药质量控制和品种分类等方面[9]。本研究采用SPSS24.0 软件分别对37 批大黄药材的红外指纹图谱和液相指纹图谱数据进行系统聚类分析，聚类方法选择组间联接法，区间选择平方欧式距离，聚类结果见图3、图4。由图3 可知，当欧式距离为20时，37 批大黄药材被聚为三大类，第一类包含3～6、11、15、16、20、22、30、32、35～37，该类包含了甘肃武都、礼县和重庆产大黄药材；第二类包含2 和8，该类产地分别是重庆和湖北；剩余聚为第三类，包含了甘肃礼县、宕昌、四川和青海产大黄药材。由图4 可知，当欧式距离为20 时，37 批大黄药材同样被聚为三大类，第一类包含了1、5～7、11、15、16、20、22、30、32、35～37，该类大黄产地分别是四川，甘肃武都、礼县和宕昌；第二类包含了2～4、8，产地分别是重庆和湖北；剩余聚为第三类，产地分别是甘肃礼县、宕昌和青海。对比两种聚类方式可知，所有甘肃武都的大黄被聚为一类，甘肃礼县和宕昌的大黄基本聚为一类，其他产地大黄为一类，两种聚类方式所得结果基本一致，但存在少数产地相互交叉的情况。

图3 37 批大黄药材红外数据聚类分析图Fig.3 Infrared data cluster analysis diagram of 37 batches of Rhubarb

图4 37 批大黄药材HPLC 数据聚类分析图Fig.4 Cluster analysis of HPLC data of 37 batches of Rhubarb

3.2 大黄药材原始红外光谱分析

由聚类分析结果发现，部分产地大黄药材聚类结果存在相互交叉的情况，现从各产地选择一批具有代表性的大黄样品，结合掌叶大黄和药用大黄对照药材进一步分析，所得原始红外光谱见图5。通过图谱可知，大黄在3413、2930、1627、1448、1374、1317、1051、780、518 cm-1附近有吸收峰存在。其中3413 cm-1附近为羟基的伸缩振动吸收峰；2930 cm-1为亚甲基的反对称伸缩振动吸收峰；1627 cm-1为羰基伸缩振动吸收峰；1448 cm-1附近可能包含多种成分，如芳香环骨架伸缩振动、C-H 弯曲振动以及（O）C-O 伸缩振动；1373 cm-1为C-H 弯曲振动吸收峰；1051 cm-1附近是多个吸收峰重叠产生的宽强峰，主要是多糖和苷类物质的C-OH 弯曲振动产生。1317、780、518cm-1一系列主要为草酸钙的吸收峰。大黄中含较多蒽醌类物质，多羟基蒽醌中的羟基会与羰基发生氢键螯合，致使羰基的伸缩振动吸收峰向低波数一端移动，并同芳香环骨架振动吸收峰合并，还包含了草酸钙的吸收峰，最终形成1627 cm-1附近的强吸收峰.

由掌叶大黄与药用大黄对照药材红外谱图比较（见图5）可知，掌叶大黄在1317、780、518 cm-1处的吸收峰要强于药用大黄，且峰形更加尖锐。药用大黄在1516、1241 cm-1处存在的吸收峰，而在掌叶大黄光谱中并无显现。这些特征峰差异能够将掌叶大黄与药用大黄进行区别。通过对图5 中各产地大黄药材的红外图谱比较，甘肃礼县、宕昌、武都和青海的大黄药材在1317、780、518 cm-1附近有明显的吸收峰，而湖北、重庆和四川产地并不明显。湖北、重庆和四川产地大黄药材图谱在1516、1241 cm-1附近存在的吸收峰，而甘肃礼县、宕昌、武都和青海产地大黄药材的图谱中并不存在。

图5 7 批不同产地大黄药材红外光谱Fig.5 IR spectra of 7 batches of Rhubarb from different origins

以掌叶大黄对照药材作为参照，用OMNIC 软件计算各产地大黄药材与掌叶大黄对照药材的相关系数，甘肃礼县、宕昌、武都，青海、湖北、重庆和四川等地分别为：0.9748、0.9669、0.9282，0.9582、0.8211、0.8413 和0.8818；以药用大黄对照药材作为参照，计算出相关系数分别为：0.9199、0.9126、0.8823、0.8605，0.9392、0.9383、0.9419。由此可知甘肃礼县、宕昌、武都和青海产的大黄与掌叶大黄对照药材更加接近，湖北、重庆和四川产的大黄与药用大黄对照药材更加接近。

通过对四川、重庆、湖北、青海，甘肃礼县、宕昌、武都等地大黄药材红外光谱进行分析，发现四川、重庆、湖北三地大黄药材红外光谱在1516、1241 cm-1附近均存在吸收峰，由此可知该产地大黄品种为药用大黄。而青海，甘肃礼县、宕昌、武都等地大黄药材红外光谱在1317、780、518 cm-1附近有明显的吸收峰，由此可知该产地大黄品种为掌叶大黄（见图6、7、8、9）。因此，通过各产地大黄药材原始红外光谱以及药材光谱与对照药材的相关系数分析，能将甘肃礼县、宕昌、武都，青海、湖北、重庆和四川等地大黄品种进行区分。

图6 四川、重庆、湖北、青海大黄药材红外光谱Fig.6 IR spectra of Rhubarb from Sichuan,Chongqing,Hubei and Qinghai

图7 礼县大黄药材红外光谱Fig.7 IR spectra of Rhubarb from Lixian

图8 宕昌大黄药材红外光谱Fig.8 IR spectra of Rhubarb from Dangchang

图9 武都大黄药材红外光谱Fig.9 IR spectra of Rhubarb from Wudu

3.3 大黄药材IR 二阶导数光谱分析

红外原始光谱虽能区分大黄的品种类型，但主要特征峰峰形、峰位相似，若想对其进一步分析，需要对原始光谱图进行导数处理。二阶导数光谱是对原始光谱进行二次微分后而得到的吸光度与波数关系的变化率曲线，它能够分辨原始光谱中的重叠峰，突出谱图的特征性，增强谱图的差异性。

由图10 可见，在1250～1200 cm-1波段，除甘肃礼县外其他三个地区的大黄药材均在1240、1207 cm-1两处有吸收峰，可鉴别出甘肃礼县大黄。甘肃武都大黄在1011 cm-1处存在一个较强吸收峰，而其他产地并未出现，可将甘肃武都与其他产地区分出来。由图11 可见，在700～600 cm-1波段，青海产大黄在679、617 cm-1存在两个吸收峰，并且在407 cm-1处存在吸收峰，而甘肃宕昌大黄在这些波数处并无吸收峰，可将甘肃宕昌与青海大黄区分开来。

图10 4 批大黄药材二阶导数图谱（1800～1000cm-1）Fig.10 Second derivative spectra of 4 batches of Rhubarb

图11 4 批大黄药材二阶导数图谱（1000～400cm-1）Fig.11 Second derivative spectra of 4 batches of Rhubarb

由图12 可见，在1600～1500 cm-1波段，四川产大黄在1557、1530、1512 cm-1有三处吸收峰，其他两地大黄只有两处吸收峰，由此可将四川产大黄鉴别出来。在1100～900 cm-1波段，湖北产大黄的所有吸收峰均强于其他两地；在800～750 cm-1波段，重庆产大黄存在765 cm-1一处吸收峰，而湖北产大黄却分为778、755 cm-1两处吸收峰，这能够将湖北与重庆产大黄区分开来。

图12 3 批大黄药材二阶导数图谱（1800～400 cm-1）Fig.12 Second derivative spectra of 3 batches of Rhubarb

3.4 HPLC 指纹图谱分析

使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012软件对七批不同产地大黄进行相似度分析（图13），以掌叶大黄对照药材作为标准时，甘肃礼县、宕昌、武都和青海四地产大黄与对照药材相似度较高（见表2）；以药用大黄对照药材作为标准时，湖北、重庆和四川三地产大黄对照药材相似度较高（见表3）。由此可判断甘肃礼县、宕昌、武都和青海四地产大黄为掌叶大黄，而湖北、重庆和四川三地产大黄为药用大黄，这与红外分析结果相一致。

图13 不同产地大黄药材HPLC 指纹图谱Fig.13 HPLC Fingerprint of Rhubarb from different origins

表2 不同产地大黄药材与掌叶大黄对照药材HPLC 指纹图谱相似度计算Table 2 HPLC fingerprint similarity calculation results of Rheum palmatum L.and rhubarb from different habitats

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表3 不同产地大黄药材与药用大黄对照药材HPLC指纹图谱相似度计算Table 3 HPLC fingerprint similarity calculation results of Rheum officinale Baill.and rhubarb from different habitats

4 讨论与结论

根据聚类分析结果可知，当欧式距离为20 时，所有大黄药材大致可分为三类，两种分析方法聚类结果基本一致，但还是存在一定差异。分析原因，HPLC 指纹图谱仅显示在特定波长下存在紫外吸收的化合物[10～11]，不能反映出大黄药材中的全部物质，聚类时使用指纹图谱中的共有峰进行聚类分析；而红外光谱能够反映出大黄药材中的全部物质，不仅包含HPLC 指纹图谱中所显示的化合物，还包含草酸钙类无机物，聚类时使用每个红外光谱中全波段对应的吸光度进行聚类分析。

经过对原始红外光谱、二阶导数光谱的分析，结果表明：（1）原始红外光谱只能将不同产地大黄药材的品种进行区分，而无法区分其产地。（2）二阶导数光谱能够将不同产地的大黄药材完全鉴别出来，在1600～1500、1250～1200、1011、1100～900、800～750、700～600、407 cm-1附近的特征峰位置、强度和形态上均存在明显差异，由此可将不同产地的大黄药材区分开来。不同产地大黄HPLC 指纹图谱相似度分析结果显示，甘肃礼县、宕昌、武都，青海等地产大黄与掌叶大黄对照药材相似度较高，湖北、重庆、四川等地产大黄与药用大黄对照药材相似度较高。由这一结果可推断出各产地大黄药材的品种，但无法区分其产地。

FT-IR 能够在谱图中反映出大黄药材的所有化学成分，经过处理后能够放大其特征，达到区分不同产地的目的。但正是由于这种整体性，使得难以从红外光谱中得到每一化学成分的准确含量。而HPLC 无法反映出大黄药材中的全部成分，但通过色谱峰能够得到所对应化合物的准确含量。因此，在进行含量测定时，HPLC 具有其优势[12]，但对于不同产地大黄药材的区分，FT-IR 简便、迅速，在全面快速大黄药材方面有其独特的优势。